【摘 要】
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研究背景和目的:病理条件下神经胶质细胞（卫星胶质细胞,小胶质细胞,少突胶质细胞）从静止形式迅速转变为活化形式。探讨胶质细胞的活化及其可能机制,对认识神经系统疾病的病理生理过程具有重要的研究价值。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）可作用于背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）卫星胶质细胞（satellite glial cells,SGCs）与
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研究背景和目的:病理条件下神经胶质细胞（卫星胶质细胞,小胶质细胞,少突胶质细胞）从静止形式迅速转变为活化形式。探讨胶质细胞的活化及其可能机制,对认识神经系统疾病的病理生理过程具有重要的研究价值。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）可作用于背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）卫星胶质细胞（satellite glial cells,SGCs）与脊髓小胶质细胞（microglia,MG）上P2X4受体介导胶质细胞的活化。作为炎症介质的神经内分泌多肽儿茶酚抑素（Catestatin,CST）与心血管疾病等发病过程密切相关,目前关于其在有炎症因子参与的胶质细胞活化中的作用尚未报道。本研究旨在观察CST在P2X4受体介导原代培养的背根神经节SGCs和脊髓MG活化中的作用及其可能机理。方法:本课题研究对象为大鼠原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG。应用CCK8、q PCR（Quantitative real-time PCR,q PCR）和Western Blot法检测各浓度ATP和CST对背根神经节SGCs活性的影响;通过免疫荧光双标法分别检测原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG中P2X4受体的表达;通过q PCR和Western Blot分别检测原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG中P2X4mRNA和ERK/P-ERK受体蛋白的表达;应用试剂盒检测原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG上清液中TNF-α的含量及IL-1β的水平。结果:1、通过免疫荧光法检测背根神经节SGCs和脊髓MG特异性标志物GFAP/CD11b,纯度分别在95%和90%以上。2、ATP/CST对原代培养背根神经节SGCs存活的影响:使用CCK8方法检测不同浓度ATP/CST对原代培养背根神经节SGCs的存活影响,提示CST可能增强ATP诱导的背根神经节SGCs活化。3、实时定量PCR检测ATP对P2X4mRNA水平的影响:使用q PCR方法检测各组原代培养背根神经节SGCs中P2X4mRNA的相对表达量。结果显示在ATP处理浓度为0.1m M时,P2X4mRNA表达上升趋势最明显,蛋白印迹检测ATP对P2X4受体蛋白表达的结果与实时定量PCR结果类似。4、CST对原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG形态的影响:倒置显微镜观察正常背根神经节SGCs/脊髓MG加入ATP后,细胞形态变化均增强。5、实时定量PCR检测CST对P2X4mRNA水平的影响:结果显示:与对照组相比,ATP组P2X4mRNA表达显著增加;ATP+CST组P2X4mRNA表达明显高于ATP组。以上研究结果表明,CST能上调原代培养背根神经节SGCs/脊髓MG中P2X4mRNA水平。6、蛋白印迹检测CST对P2X4受体蛋白表达的影响:结果显示:与对照组相比,ATP组P2X4受体蛋白表达均明显增加;与ATP组相比,ATP+CST组P2X4蛋白表达水平明显高于ATP组。以上结果表明CST可增强ATP诱导的背根神经节SGCs/脊髓MG中P2X4受体的表达7、免疫荧光双标法分别检测原代培养背根神经节SGCs中GFAP与P2X4受体和脊髓MG中CD11b与P2X4受体共表达,结果显示:P2X4受体与SGCs中ATP组GFAP和MG中ATP组CD11b共表达均高于对照组,ATP+CST组高于ATP组。结果提示CST可增加背根神经节SGCs和脊髓MG中P2X4和GFAP/CD11b的共表达。8、ERK1/2信号通路在CST增强P2X4介导原代培养背根神经节SGCs/脊髓MG活化中的作用:ATP组背根神经节SGCs和脊髓MG中p-ERK1/2与ERK1/2的积分光密度比值均高于Control组,ATP+CST组与ATP组相比,经CST处理的ATP组p-ERK1/2与ERK1/2的积分光密度比值均显著增加,与对照组相比,ATP组统计学数据有明显差异。结果表明,CST对P2X4受体介导的背根神经节SGCs和脊髓MG活化的增强作用可能与ERK1/2的磷酸化有关。9、ELISA检测原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG上清液中TNF-α和IL-1β的含量:统计分析结果显示:与对照组比,ATP组的TNF-α表达水平均高于对照组,与ATP组比,ATP+CST组的TNF-α表达水平均高于ATP组;IL-1β的检测结果表现出相同的趋势。这些结果表明,CST能够增加活化后背根神经节SGCs和脊髓MG中TNF-α和IL-1β的含量表达。结论:CST可增强P2X4受体介导的原代培养背根神经节SGCs和脊髓MG的活化,ERK-MAPK信号通路可能涉及其活化过程。
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