目的:TMEM16A（也称为Anoctamin 1,ANO1）是钙激活氯离子通道的分子基础,有10个跨膜结构域。TMEM16A广泛分布在多种细胞中,并参与调节多种重要的生理功能。TMEM16A在包括乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达且与患者的不良预后相关。他汀类药物（statins）是临床常用的一线降脂药,为羟甲基戊二酸单酰辅酶A（HMG-Co A）还原酶抑制剂,常用于心血管疾病的治疗。他汀类药物对包括乳腺癌在内的多种肿瘤有抑制作用。和亲水性他汀类药物相比,包括辛伐他汀在内的亲脂性他汀类药物可以明显抑制乳腺癌的复发和转移。本实验的前期研究显示,亲脂性他汀和亲水性他汀在抑制TMEM16A钙激活氯电流和抑制乳腺癌增殖能力方面存在差异。因此,本研究的目的是探究辛伐他汀对TMEM16A的抑制能力及对结合起着关键作用的氨基酸,阐明辛伐他汀抑制乳腺癌细胞TMEM16A钙激活氯通道的机制,寻找TMEM16A促进乳腺癌发生发展的信号通路,并验证辛伐他汀通过TMEM16A介导的信号通路抑制乳腺癌的作用机制,为开发靶向TMEM16A的药物用于治疗乳腺癌提供新思路与实验依据。方法:本研究通过CCK-8细胞活力法检测辛伐他汀（辛伐他汀酸为对照）处理之后的乳腺癌细胞增殖能力;在HEK293细胞中转染TMEM16A质粒,应用全细胞膜片钳（Whole cell）记录模式,检测并比较不同浓度辛伐他汀处理后HEK293T细胞钙激活氯电流;通过引物设计和位点定向突变（site-directed mutagenesis）方法,将TMEM16A中的氨基酸系统地突变为TMEM16B中相应序列的氨基酸,应用质粒转化和提取技术,扩增并提取TMEM16A突变体质粒,培养HEK293T,依靠瞬时转染技术,在HEK293细胞中转染含TMEM16A突变体质粒,应用全细胞膜片钳技术,检测并比较辛伐他汀处理前后转染TMEM16A突变体（WT TMEM16A为对照）的HEK293细胞钙激活氯电流,验证TMEM16A与辛伐他汀结合的关键氨基酸;通过对TCGA数据库和GSEA基因富集分析,探讨TMEM16A在乳腺癌中的基因富集情况;通过sh RNA敲除TMEM16A及转染含有TMEM16A质粒到MCF-7和T47D乳腺癌细胞,构建TMEM16A沉默或过表达乳腺癌细胞模型;应用Western blot方法检测并比较TMEM16A沉默及过表达乳腺癌细胞中EGFR、AKT磷酸化表达水平;检测辛伐他汀处理后乳腺癌MCF-7细胞中EGFR、AKT磷酸化表达水平。结果:CCK-8细胞活力法检测MCF-7和T47D细胞增殖能力,结果显示辛伐他汀可明显抑制乳腺癌MCF-7和T47D细胞增殖,并呈浓度依赖性。转染TMEM16A质粒的HEK293T细胞钙激活氯电流,辛伐他汀对TMEM16A钙激活氯电流呈现剂量依赖性。通过位点定向突变方法,将TMEM16A突变体转染至HEK293T细胞中,应用全细胞膜片钳技术（Whole cell）记录转染TMEM16A突变体的钙激活氯电流变化情况,结果显示R429A、K430L、R437F降低了辛伐他汀诱导的TMEM16A钙激活氯电流的抑制;R429A/K430L/R437F也降低了辛伐他汀诱导的TMEM16A钙激活氯电流的抑制。应用Western blot检测转染含有TMEM16A过表达质粒和Sh RNA敲除质粒检测MCF-7和T47D磷酸化EGFR和AKT表达水平,结果显示转染高表达TMEM16A细胞中磷酸化EGFR和AKT蛋白表达显著升高,提示TMEM16A高表达可能激活EGFR/AKT信号通路;辛伐他汀处理后乳腺癌T47D细胞中磷酸化EGFR/AKT的表达降低。结论:我们研究发现辛伐他汀抑制乳腺癌细胞增殖,对TMEM16A钙激活氯通道剂量依赖性地抑制。确认辛伐他汀与TMEM16A直接结合的关键氨基酸:R429A、K430L、R437F。实验表明TMEM16A钙激活氯通道能够激活乳腺癌细胞EGFR/AKT信号通路;TMEM16A过表达乳腺癌细胞中磷酸化EGFR/AKT蛋白表达显著增高,TMEM16A沉默后EGFR和AKT的磷酸化蛋白表达水平降低,TMEM16A钙激活氯通道功能有促进乳腺癌发生发展作用。研究表明辛伐他汀抑制乳腺癌细胞中磷酸化EGFR、AKT的表达。