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第一部分孕酮通过孕酮核受体上调TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌发生发展的机制研究目的:探讨TMEM16A钙激活氯通道对乳腺癌PR信号通路的影响。方法:采用TCGA数据库和免疫组化方法检测TMEM16A在PR阳性和PR阴性的人乳腺癌组织中的表达差异。采用Western blot方法检测在MCF-7细胞系给与不同浓度（0.1-100 n M）孕酮处理0h-24h以及孕酮和米非司酮联合给药24h后TMEM16A的表达情况。双荧光素酶报告基因系统检测PR与TMEM16A启动子区相互作用。通过TMEM16A过表达质粒或TMEM16A-sh RNA质粒转染MCF-7,获得TMEM16A高表达或低表达水平的细胞系。Western blot检测含不同TMEM16A表达水平的MCF-7细胞中TMEM16A、PR-B、PR-A以及EGFR和STAT3总蛋白和磷酸化蛋白的表达。采用CCK-8法检测不同TMEM16A表达水平的MCF-7细胞增殖情况,以及敲减TMEM16A再给与孕酮处理的MCF-7细胞增殖情况。采用Western blot方法检测转染TMEM16A-OE质粒后给与STAT3抑制剂处理24h后PR-B的表达情况。在T47D另一乳腺癌细胞系上验证上述结果。采用膜片钳技术分别记录T47D给与不同浓度内钙刺激;敲减TMEM16A后;给与孕酮预处理24h后以及孕酮预处理再给与TMEM16A通道抑制剂T16Ainh-A01（20μM）的钙激活氯电流。分别采用Western blot方法和CCK-8法检测给与TMEM16A通道抑制剂T16Ainh-A01后EGFR和STAT3总蛋白和磷酸化蛋白的表达以及细胞增殖情况。采用Western blot方法检测转染△444EEEEEAVKD452突变体的乳腺癌细胞中TMEM16A、PR-B、PR-A以及EGFR和STAT3总蛋白和磷酸化蛋白的表达。结果:PR阳性乳腺癌样本比PR阴性乳腺癌样本,TMEM16A高表达的例数更多。孕酮通过PR与TMEM16A启动子区相互作用,增加TMEM16A的表达。TMEM16A过表达通过激活EGFR/STAT3信号通路增加了PR-B的表达。TMEM16A与PR-B相互激活介导了孕酮诱导的细胞增殖。在T47D细胞系记录到的钙激活氯电流,具有钙依赖性和电压依赖性的特点。T47D细胞经孕酮预处理24h后,与对照组相比钙激活氯电流增大;急性加药T16A inh-A01后,钙激活氯电流逐渐减小。TMEM16A通道功能被抑制,降低了EGFR/STAT3信号通路表达,降低了孕酮诱导的细胞增殖。转染△444EEEEEAVK452突变体的乳腺癌细胞,TMEM16A通道功能受抑制,降低了EGFR/STAT3信号通路表达,减少了PR-B的表达。结论:孕酮通过孕酮核受体与TMEM16A启动子相结合上调TMEM16A钙激活氯通道,促进钙激活氯电流。TMEM16A通过EGFR/STAT3信号通路促进乳腺癌细胞PR-B表达。TMEM16A介导PR促进乳腺癌细胞增殖。TMEM16A与PR-B相互激活形成正反馈环路。TMEM16A通道活性的增强介导了孕酮促进乳腺癌细胞增殖。第二部分Moesin调节TMEM16A通道功能促进乳腺癌细胞增殖目的:探究moesin参与TMEM16A通道的门控调节和下游信号转导的机制。方法:应用全细胞膜片钳技术记录转染moesin过表达或空载体质粒的T47D细胞分别被0.36μM、1μM、25μM和126μM细胞内液Ca2+激活的TMEM16A氯电流。分别采用Western blot、CCK-8法检测转染TMEM16A过表达质粒的T47D细胞中TMEM16A、p-EGFR、EGFR、p-STAT3和STAT3的蛋白表达和细胞增殖情况。分别采用Western blot、CCK-8检测T47D细胞转染TMEM16A过表达质粒、TMEM16A过表达质粒+sh RNA-moesin后,p-EGFR、EGFR、p-STAT3、STAT3的蛋白表达和细胞增殖情况。结果:转染moesin过表达质粒后TMEM16A钙激活氯电流增加;TMEM16A Ca2+敏感性增加了大约10倍,对照组EC50为29.37μM,moesin过表达组EC50为3.20μM。细胞转染moesin过表达质粒后T47D细胞中TMEM16A的激活电流拟合为两项,包括快的和慢的组分;而对照组细胞的激活电流拟合为一项。与我们之前的发现相符,TMEM16A过表达会导致EGFR和STAT3磷酸化蛋白表达增加,并促进T47D细胞增殖。通过转染sh RNA-moesin质粒抑制了TMEM16A过表达引起的EGFR/STAT3激活,并阻止TMEM16A过表达诱导的T47D细胞增殖。结论:Moesin促进T47D细胞中TMEM16A通道Ca2+敏感性和激活动力学。Moesin介导TMEM16A过表达通过激活EGFR/STAT3信号通路诱导的T47D细胞增殖。第三部分:TMEM16A高表达通过EGFR/STAT3/ROCK1促进乳腺癌侵袭转移的机制研究目的:TMEM16A高表达促进乳腺癌侵袭转移的机制研究。方法:利用TCGA数据库分析TMEM16A高低表达对肿瘤大小（T）、淋巴结转移（N）、乳腺癌分期（Stage）以及乳腺癌患者生存期的影响。采用免疫组化方法分析乳腺癌患者TMEM16A高低表达对淋巴结转移情况的影响。分别采用划痕实验、Transwell实验验证不同TMEM16A表达水平的乳腺癌细胞迁移和侵袭情况。建立裸鼠转移瘤模型,采用HE染色检测不同TMEM16A表达水平的乳腺癌细胞成瘤情况。利用TCGA数据库分析TMEM16A与ROCK1的相关性,以及TMEM16A与ROCK1联合表达对淋巴结转移、乳腺癌分期、乳腺癌病人生存期的影响。采用Western blot方法检测转染TMEM16A-OE、TMEM16A-sh RNA质粒的MCF-7乳腺癌细胞ROCK1的表达情况。采用划痕实验、Transwell实验检测给与ROCK1抑制剂Y-27632后,MCF-7细胞侵袭迁移能力的改变。利用TCGA数据库分析EGFR与ROCK1的相关性。采用Western blot方法检测经EGF刺激后MCF-7细胞的ROCK1表达情况,以及给与EGFR抑制剂吉非替尼、STAT3抑制剂JSI-124处理后下游通路蛋白和ROCK1的表达情况。采用划痕实验、Transwell实验检测分别给与吉非替尼、JSI-124后,MCF-7乳腺癌细胞的侵袭迁移能力的改变。在另一株乳腺癌细胞T47D上验证上述结果。应用膜片钳技术记录给与T16Ainh-A01后,T47D细胞的TMEM16A钙激活氯电流的变化。采用Transwell实验检测给与T16Ainh-A01或转染△444EEEEEAVKD452质粒后,乳腺癌细胞侵袭能力的改变。结果:TMEM16A高表达较低表达的乳腺癌患者肿瘤更大,淋巴结受累数更多,乳腺癌临床分期更严重,生存期更短。TMEM16A高表达促进乳腺癌细胞侵袭迁移;尾静脉注入高表达TMEM16A的MCF-7细胞的裸鼠,肺组织成瘤数目更多。ROCK1与TMEM16A呈正相关,TMEM16A与ROCK1联合高表达较低表达的乳腺癌患者淋巴结转移数更多,乳腺癌临床分期更严重,生存期更短。在MCF-7细胞中,TMEM16A高表达促进ROCK1高表达;给与Y-27632抑制了乳腺癌细胞的侵袭迁移。EGFR与ROCK1呈正相关,EGF刺激ROCK1表达;吉非替尼、JSI-124抑制下游通路蛋白和ROCK1表达,同时抑制了MCF-7细胞的侵袭迁移。在T47D乳腺癌细胞也可重复出上述结果。T16Ainh-A01抑制了TMEM16A钙激活氯电流和乳腺癌细胞的侵袭。转染了△444EEEEEAVKD452质粒的乳腺癌细胞,ROCK1蛋白表达量减少,侵袭能力减弱。结论:TMEM16A通过EGFR/STAT3/ROCK1信号通路促进乳腺癌细胞侵袭迁移;提高TMEM16A钙激活氯通道的通道活性促进乳腺癌细胞侵袭。