【摘 要】
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第一部分ROCK1通过磷酸化moesin促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性目的:探讨Rho A/ROCK通路是否参与调节乳腺癌细胞TMEM16A通道活性。方法:应用全细胞膜片钳技术记录给予ROCK1抑制剂Y-27632前后T47D细胞在1μM内钙激活的TMEM16A氯电流。采用Western blot法检测转染Rho A活性突变体V14和无活性突变体19N质粒的T47D细胞中p-ROCK、RO
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第一部分ROCK1通过磷酸化moesin促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性目的:探讨Rho A/ROCK通路是否参与调节乳腺癌细胞TMEM16A通道活性。方法:应用全细胞膜片钳技术记录给予ROCK1抑制剂Y-27632前后T47D细胞在1μM内钙激活的TMEM16A氯电流。采用Western blot法检测转染Rho A活性突变体V14和无活性突变体19N质粒的T47D细胞中p-ROCK、ROCK、pmoesin和moesin的蛋白表达情况。全细胞膜片钳技术记录转染Rho A活性突变体V14/无活性突变体19N质粒以及moesin持续磷酸化T558D突变体/抑制磷酸化T558A突变体质粒的T47D细胞在1μM内钙激活的TMEM16A氯电流。并在转染TMEM16A过表达质粒的人胚肾HEK293细胞中验证moesin磷酸化对TMEM16A通道活性的影响。结果:给予ROCK1抑制剂Y-27632显著抑制了乳腺癌T47D细胞中TMEM16A钙激活氯电流。Western-Blot结果显示,转染Rho A活性突变体V14质粒导致p-ROCK1和p-moesin蛋白量表达增加。与转染Rho A-V14突变体过表达质粒相比,转染Rho A-19N突变体质粒的T47D细胞中钙激活氯电流显著减少。提示在乳腺癌细胞中Rho A的激活可以活化ROCK1和磷酸化moesin,进而促进TMEM16A通道活性。与转染抑制moesin磷酸化的T558A突变体的T47D细胞相比,转染moesin持续磷酸化T558D突变体质粒的T47D和HEK293细胞上TMEM16A钙激活氯电流显著增加。表明ROCK1是通过moesin T558位点的磷酸化促进了TMEM16A通道的活性。结论:ROCK1促进乳腺癌细胞中TMEM16A通道活性,Rho A/ROCK1信号通路是通过moesin 558位苏氨酸磷酸化而增强TMEM16A钙激活氯电流。第二部分Moesin参与调控TMEM16A钙激活氯通道促进乳腺癌细胞侵袭转移目的:Moesin促进乳腺癌侵袭转移的机制研究。方法:应用TCGA数据库分析乳腺癌患者中TMEM16A和moesin的ROC曲线,生存曲线及两者相关性。应用划痕实验、transwell实验检测在共转染高表达TMEM16A和moesin scramble对照质粒/moesin-sh RNA敲低质粒后,乳腺癌MCF-7细胞的侵袭迁移情况。分析不同moesin表达情况对过表达TMEM16A促进的乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响。应用细胞划痕实验、transwell实验检测转染moesin持续磷酸化突变体（moesin-T558D）、抑制磷酸化突变体（moesin-T558A）质粒后,乳腺癌MCF-7细胞的侵袭迁移情况。分析moesin磷酸化对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响。在另一株乳腺癌细胞T47D上采用划痕实验、transwell细胞侵袭迁移实验验证上述结果。结果:TCGA数据库分析显示在未经药物治疗的乳腺癌患者中,TMEM16A和moesin联合表达与乳腺癌不良预后相关。细胞划痕和transwell侵袭迁移实验结果显示,过表达TMEM16A促进乳腺癌细胞MCF-7和T47D的侵袭迁移,敲低moesin之后与对照组（moesin scramble）相比抑制了TMEM16A促进的乳腺癌细胞侵袭迁移情况。证明TMEM16A通过moesin促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移。与空质粒对照组相比,moesin-T558D组促进了乳腺癌细胞的侵袭迁移,moesin-T558A组与moesin-T558D组相比抑制了乳腺癌细胞侵袭迁移。证明moesin可以通过对T558位点的磷酸化介导乳腺癌细胞的侵袭和迁移。结论:TCGA数据库分析显示TMEM16A和moesin联合表达与乳腺癌不良预后相关。TMEM16A高表达所促进的乳腺癌细胞侵袭迁移可被moesin敲低所抑制,moesin通过558位苏氨酸磷酸化介导乳腺癌细胞侵袭迁移。
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