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目的:钙激活氯通道（Ca CCs）是一类非常重要的调节细胞功能的膜蛋白,广泛分布于血管内皮、呼吸道内皮、胰腺腺泡、乳腺等多种组织器官中,调节着机体内多种生理功能和病理过程。TMEM16A作为一种具有电压依赖性-外向整流特点的钙激活氯通道,在多种病理生理过程中发挥重要的作用,如避免卵母细胞的多重受精、介导平滑肌收缩、介导上皮细胞的液体分泌、介导感官信号传导以及促进肿瘤的发生和发展等。随着人们对TMEM16A的研究逐步加深,目前主要聚焦于TMEM16A作为药物作用靶点及TMEM16A的功能调控机制的研究。本研究中使用磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）和和厚朴酚分别作为TMEM16A通道激活剂及抑制剂,应用氨基酸定点突变及电生理技术对PIP2和和厚朴酚与TMEM16A通道的结合位点进行研究,进而对开发作用于TMEM16A特异性药物提供理论基础。和厚朴酚是中药厚朴的一种活性成分,其具有明显的、持久的中枢性肌肉松弛作用,中枢神经抑制作用,抗炎,抗菌,抗病原微生物,抗溃疡,抗氧化,抗衰老,抗肿瘤,降低胆固醇等药理作用。我们课题组前期研究发现,在全细胞记录模式下和厚朴酚对TMEM16A电流具有抑制作用,在应用氨基酸定点突变进行和厚朴酚结合位点的研究中,证实TMEM16A序列中R429和K430可能是其关键的结合位点,与H Criss.Hartzell等报导的PIP2和TMEM16A结合位点相同,但是两者是否能够竞争性结合相同位点尚未明确。本研究应用Inside-out记录模式,将和厚朴酚与PIP2分别单独及顺序给药,对两药是否竞争性结合同一位点进行研究。PIP2是一种磷脂,其仅占膜磷脂的不到1%,但功能却非常复杂。这种低丰度的多磷酸肌醇脂可被Gq型G蛋白偶联受体活化的磷脂酶C（PLC）水解为三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）并参与信号传递。IP3结合并激动内质网膜上的IP3受体触发Ca2+的释放,释放出来的Ca2+结合TMEM16A蛋白引起构象变化介导通道的开放。PIP2为带负电荷的极性分子,其靶蛋白结合位点通常是带正电荷的氨基酸。一个众所周知的PIP2结合位点是Pleckstrin Homology（PH）结构域,它将PIP2结合在一个碱性氨基酸口袋中,这些氨基酸在一级序列中并不相邻,但在折叠蛋白中非常接近。有研究表明,TMEM16A结构中具有多个P IP2结合位点,根据结合位点的不同,进而为TMEM16A的功能调控机制研究提供新的依据。本研究主要通过电生理膜片钳Inside-out记录方式,将PIP2与和厚朴酚分别单独及顺序给药作用于野生型TMEM16A通道、突变型TMEM16A通道（R429A和K430L）,旨在研究两者对TMEM16A的功能调控的关键结合位点以及两者是否存在竞争性结合的位点,为靶向设计、优化作用于TMEM16A通道的药物提供坚实的理论基础。实验方法:本研究通过质粒转化和提取技术,扩增并提取m TMEM16A-EG FP质粒,通过PCR定点突变技术,将其突变为R429A、K430L两种单位点突变质粒和R429A-K430L双位点突变质粒。依靠瞬时转染技术,在HEK293细胞上分别转染m TMEM16A-EGFP质粒,R429A突变质粒,K430L突变质粒,R429A-K430L双位点突变质粒,采用膜片钳Inside-out记录方式,进行细胞膜内给药,在270n M钙浓度实验条件下,记录PIP2和和厚朴酚分别单独给药及顺序给药对转染各种野生型、突变型TMEM16A电流的影响。实验结果:使用Inside-out膜片钳实验记录方式,在270n M钙浓度条件下,发现PIP2对转染m TMEM16A-EGFP质粒,R429A、K430L两种单位点突变质粒和R429A-K430L双位点突变质粒四种质粒的HEK293细胞的TMEM16A电流产生不同的激活作用。激活作用为野生型>两种单突变型>双突变型,依次为78.6%（WT）、19.8%（R429A）、12.8%（K430L）、8.16%（R429A-K430L）。同样,在相同实验条件下,和厚朴酚对TMEM16A电流的抑制作用发生了改变,抑制率为野生型>单突变型>双突变型,抑制率依次为61.6%（WT）、46.6%（R429A）、43.9%（K430L）、27.1%（R429A-K430L）。在转染野生型TMEM16A的HEK293细胞中顺序给予PIP2和和厚朴酚时,和厚朴酚对TMEM16A的药物抑制作用远低于单独给与和厚朴酚时的抑制作用。而在转染双突变质粒的HEK293细胞中顺序给予PIP2和和厚朴酚时,和厚朴酚对TMEM16A电流的抑制作用与在转染双突变质粒的HEK293细胞上单独给予和厚朴酚时几乎相同。实验结论:研究证实了外源性PIP2对TMEM16A的激活作用与和厚朴酚对TMEM16A的抑制作用。单位点突变后,激活作用和抑制作用都显著降低,证明R429和K430两个位点为PIP2、和厚朴酚与TMEM16A结合位点中的两个重要位点。进而,我们实验室在证明和厚朴酚与TMEM16A结合位点包括R429和K430两个位点的情况下,发现在转染野生型TMEM16A的HEK293细胞中顺序给予两种药物后,和厚朴酚对TMEM16A电流的抑制率远低于单独给予和厚朴酚时的抑制率,然而在转染双突变质粒后,顺序给予两种药物后,和厚朴酚对TM EM16A电流的抑制率与单独给予和厚朴酚时的抑制率相似,说明PIP2和和厚朴酚在R429和K430两个结合位点具有竞争性的关系。该研究为外源性PIP2与和厚朴酚对TMEM16A通道功能调控及作用机制提出了新的观点,同时对进一步研究其他药物与TMEM16A作用位点提供了新的方向。