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研究背景和目的:脓毒症（Sepsis）因其在全球范围内的高发病率和高死亡率一直广受关注,系急危重症领域的世界性难题。脓毒症发病机制复杂,近年来的研究提示,脓毒症发病过程中伴有复杂多变的免疫反应,早期即存在促炎和抗炎机制的交替或同时发生,大多数脓毒症患者迅速表现出严重的免疫抑制现象,与不良预后密切相关。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是一类在先天性免疫和适应性免疫应答中起关键桥梁作用的抗原提呈细胞,其数量减少及功能障碍是脓毒症免疫紊乱的重要特征。细胞焦亡是近年来发现并证实的一种特异性依赖于半胱天冬酶（caspase,Casp）-1和/或Casp-11/4/5活化的炎性程序性细胞死亡方式,表现为细胞膜形成孔洞、细胞胀大破裂、细胞内容物释放,激发强烈的炎症反应和器官损害,在脓毒症发病及病程进展中具有重要地位,可能是脓毒症中DC数量减少和免疫功能异常的重要内因。但是目前对脓毒症状态下DC功能异常的主要病理机制尚未完全阐明,临床缺乏行之有效的调控策略。Sestrin2（SESN2）是一种重要的应激诱导蛋白,我们前期利用小鼠骨髓来源树突状细胞（DC2.4）进行研究发现,重要晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1（HMGB1）刺激可诱导DC2.4胞内SESN2蛋白表达增加,通过抑制内质网应激相关性细胞凋亡通路的激活,发挥明确的细胞保护效应。本研究以细胞焦亡的发生为切入点,重点关注SESN2蛋白表达对脓毒症状态下DC功能异常的细胞保护效应,并探讨其关键信号机制,以期为开发脓毒症免疫功能紊乱的针对性防治策略提供新思路、开辟新途径。实验方法:第一部分体内实验:采用野生型雄性C57BL/6J小鼠,构建盲肠结扎穿孔术（CLP）脓毒症模型,分别于CLP术后6、12、24、48、72小时（h）用CD11c+磁珠分离脾脏DC;体外实验:分离培养野生型小鼠脾脏DC给予1μg/ml LPS分别刺激6、24、72 h,于收集细胞前予以20μM Nigericin（Nig,一种ATP类似物）刺激30分钟（min）。采用流式细胞术检测DC焦亡率,DC分群;应用透射电子显微镜观察DC焦亡形态学变化;采用Western Blot技术分析DC中焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、GSDMD、NLRP3、ASC）和内质网应激相关蛋白（GRP78、ATF4、CHOP）表达水平;通过激光共聚焦显微镜法观察Casp-1/Tunel和NLRP3/ASC炎性小体活化;采用ELISA法检测IL-1β、IL-18、HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-25分泌水平。进一步给予内质网应激特异性激动剂衣霉素（Tm）体内（2 mg/kg）和体外（2μg/ml）刺激24 h后。采用流式细胞术检测DC焦亡率;Western Blot技术检测DC焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、GSDMD、NLRP3、ASC）和内质网应激相关蛋白（GRP78、ATF4、CHOP）表达水平。同时,通过内质网应激抑制剂Salubrinal（e IF2α去磷酸化特异性抑制剂）预处理后,采用Western Blot技术检测Cleaved-Casp-1、NLRP3、ASC表达水平。第二部分采用野生型C57BL/6J小鼠,体内实验通过CLP术构建脓毒症模型,分别于CLP术后6、12、24、48、72 h分离脾脏DC;体外实验通过分离培养野生型小鼠脾脏DC给予1μg/ml LPS分别刺激6、24、72 h,于收集细胞前予以20μM Nig刺激30 min。采用Western Blot技术检测SESN2蛋白表达水平;通过激光共聚焦显微镜法观察DC中SESN2蛋白分布。进一步利用野生型C57BL/6J小鼠和SESN2基因缺陷(SESN2-/-)小鼠,通过体内、外实验模拟脓毒症状态。采用流式细胞术检测DC焦亡率;应用透射电子显微镜观察DC焦亡形态学变化;采用Western Blot技术分析焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、GSDMD、NLRP3、ASC）表达水平;通过激光共聚焦显微镜法观察NLRP3/ASC炎性小体活化情况;采用ELISA法检测IL-1β、IL-18、HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-25细胞因子分泌水平。第三部分本部分实验利用野生型C57BL/6J小鼠,通过体内、外实验模拟脓毒症状态。采用激光共聚焦显微镜观察SESN2与内质网共定位。随后,给予2 mg/kg Tm体内和2μg/ml Tm体外刺激24 h后,采用Western Blot技术检测SESN2蛋白表达水平;同时,通过内质网应激抑制剂Salubrinal预处理后,采用Western Blot技术检测SESN2表达水平。进一步利用野生型C57BL/6J小鼠和SESN2基因缺陷(SESN2-/-)小鼠体内、外实验模拟脓毒症状态,通过激光共聚焦显微镜观察内质网形态、ATF4活化;采用Western Blot技术分析内质网应激相关蛋白（GRP78、ATF4、CHOP）表达水平。进一步采用Salubrinal干预PERK-ATF4-CHOP信号通路。采用流式细胞术检测DC焦亡率;采用Western Blot技术分析SESN2蛋白,焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、GSDMD、NLRP3、ASC）和内质网应激相关蛋白（p-PERK、PERK、GRP78、ATF4、CHOP）表达水平;通过激光共聚焦显微镜观察NLRP3/ASC炎性小体活化。结果:1.在体内CLP模型和体外LPS刺激下,脾脏DC焦亡增加,焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、GSDMD-N、NLRP3、ASC）表达上调;炎性细胞因子（IL-1β、IL-18、HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-25及IL-10）分泌在24 h时显著上调。同时,内质网应激反应明显活化,表现为GRP78、ATF4及CHOP表达增加。进一步采用Tm体内外刺激24 h后,脾脏DC焦亡率增加,焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、NLRP3、ASC、GSDMD）表达上调;随后给予不同浓度Salubrinal预处理后,可抑制LPS诱导DC中Cleaved-Casp-1、NLRP3、ASC蛋白表达。2.在体内CLP模型和体外LPS刺激下,脾脏DC和脾脏组织中SESN2蛋白表达水平升高。Tm体内外刺激可上调DC中SESN2蛋白水平,而Salubrinal预处理可下调LPS诱导的DC胞内SESN2表达。3.脓毒症早期,与野生型小鼠相比,SESN2基因敲除加剧DC焦亡,增加焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、NLRP3、ASC、GSDMD）表达,引起NLRP3/ASC炎性小体活化和炎性细胞因子（IL-1β、IL-18、HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-25及IL-10）分泌增加。同时,SESN2基因敲除可显著降低小鼠CLP术后3天生存率。4.脓毒症早期,内质网应激反应明显活化。脾脏DC中SESN2与ER存在共定位;与野生型小鼠相比,SESN2基因敲除导致内质网形态碎裂、边集;同时,SESN2基因敲除显著增加ATF4入核活化,导致过度内质网应激,表现为内质网应激相关蛋白（GRP78、ATF4、CHOP）表达显著上调。5.体内CLP模型下和体外LPS刺激下,给予Salubrinal抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路活化,可减少野生型和SESN2-/-DC焦亡率、下调焦亡相关蛋白（Cleaved-Casp-1、NLRP3、ASC、GSDMD）表达,减少NLRP3/ASC炎性小体活化。同时,提高野生型和SESN2基因缺陷小鼠CLP术后7天生存率。结论:上述实验结果证实,在脓毒症时小鼠脾脏DC发生了明显的细胞焦亡,主要由NLRP3/ASC炎性小体活化介导,且与胞内过度ERS反应密切相关;脓毒症状态下SESN2蛋白表达上调可通过拮抗PERK-ATF4-CHOP信号通路进而抑制NLRP3/ASC炎性小体的过度活化,减轻DC细胞焦亡,改善机体免疫功能状态,对脓毒症小鼠发挥明确保护作用。