Sestrin2对脓毒症状态下树突状细胞铁死亡的保护作用及其机制研究

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脓毒症是机体对感染反应失调所致的危及生命的器官功能障碍,因其在全球范围内的高发病率及高死亡率特点而备受关注,是目前急危重症领域中亟需解决的世界性难题之一。脓毒症发病过程及发病机制复杂,近年来研究提示,免疫功能障碍及免疫抑制在脓毒症发生发展过程中占据核心地位,在早期促炎及抗炎机制交替存在的同时,脓毒症患者常并发严重的免疫抑制,且与不良预后密切相关;过度炎症反应及氧化应激导致免疫功能紊乱甚至免疫麻痹,而免疫麻痹是脓毒症患者继发感染的另一主要因素。在脓毒症免疫麻痹过程中,出现不同程度的免疫细胞发育成熟滞后、活化障碍。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是表型及功能异质性免疫细胞,具有极强的抗原捕获及抗原提呈作用,在调控T淋巴细胞增殖、分化方面发挥重要作用,并启动适应性免疫应答,其数量减少和功能障碍是脓毒症免疫功能紊乱的重要特征。铁死亡是非凋亡的新型程序性细胞死亡方式,主要特征表现为依赖于铁蓄积的脂质过氧化反应。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)失活以及脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)聚集是触发铁死亡的关键因素,并释放损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs),使机体环境向促炎状态发展,在脓毒症发病及病程进展中具有重要地位,可能是导致脓毒症状态下DC数量锐减和免疫功能障碍的重要因素。Sestrin2(Sesn2)是广泛表达于哺乳动物中的高度进化保守的应激诱导蛋白家族,多种应激状态均可诱导其表达上调。我们前期利用小鼠骨髓来源树突状细胞进行研究发现,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激可诱导DC细胞内Sesn2蛋白表达上调,并通过抑制内质网应激相关通路发挥抗凋亡的保护作用。本研究以细胞铁死亡的发生为切入点,重点研究Sesn2蛋白表达对脓毒症状态下DC细胞免疫功能的保护效应,并进一步探究其关键信号机制,以期为开辟脓毒症免疫功能紊乱的防治策略提供新思路。第一部分LPS刺激下树突状细胞铁死亡规律及其免疫功能活化规律目的:探讨LPS刺激下DC铁死亡的规律及免疫功能变化。方法:采用野生型(Wild type,WT)雄性C57BL/6J小鼠,分离小鼠脾脏DC细胞进行体外培养,分别于不同时效下给予LPS不同剂量刺激DC细胞,采用Fe、GSH、ROS比色法试剂盒通过荧光酶标仪检测细胞内Fe、GSH、ROS含量;采用Western Blot技术分析DC中铁死亡相关蛋白(x CT、GPX4、ACSL4、TFRC)表达水平;同时,在LPS刺激DC前预处理两组细胞,分别给予铁死亡诱导剂Erastin(Era)和铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1),检测DC表型表达及炎性因子分泌水平,并采用流式细胞学检测T淋巴细胞增殖能力。结果:体外给予LPS(1μg/ml,24h)刺激下,DC细胞铁死亡现象明显,DC细胞内GSH明显下降、Fe2+及ROS明显升高;铁死亡相关蛋白x CT、GPX4表达降低,ACSL4、TFRC表达水平升高。在体外给予LPS(1μg/ml,12h)刺激下,DC细胞功能明显上调,表面共刺激分子CD80、CD86、MHC-II表达水平较对照组升高。铁死亡诱导剂Era组DC功能较对照组降低,对T淋巴细胞增殖作用减弱。铁死亡抑制剂Lip-1组DC功能较对照组明显增强,表面共刺激分子表达水平升高,炎症因子分泌增加;对T淋巴细胞增殖作用增强。小结:在LPS(1μg/ml,24h)刺激下DC铁死亡现象最明显;LPS(1μg/ml,12h)刺激下是DC细胞免疫功能活化的高峰期;DC铁死亡可抑制其免疫功能活化,铁死亡参与LPS诱导的DC免疫功能抑制过程。第二部分Sestrin2对LPS刺激下树突状细胞铁死亡的保护作用目的:探讨Sestrin2蛋白对LPS刺激下DC铁死亡的保护作用及对DC免疫功能的影响。方法:采用WT小鼠和Sesn2基因缺陷(Sesn2-/-)小鼠,通过分离不同基因型小鼠脾脏DC细胞,体外实验给予1μg/ml LPS后检测脓毒症状态下Sesn2蛋白表达、铁死亡及DC细胞免疫功能之间的相互关系。采用Fe、GSH、ROS比色法试剂盒通过荧光酶标仪检测细胞内含量;Western Blot技术分析DC中铁死亡相关蛋白表达水平;激光共聚焦显微镜扫描成像观察DC细胞膜脂质过氧化荧光水平以及细胞内Fe2+荧光含量;同时,LPS刺激前1h以铁死亡抑制剂Lip-1预处理DC,采用流式细胞术检测DC细胞免疫功能及对T淋巴细胞增殖能力。结果:Sesn2基因敲除DC细胞内GSH明显下降、Fe及ROS明显升高;x CT、GPX4表达降低,ACSL4、TFRC表达水平升高;DC细胞脂质过氧化程度加重;线粒体形态改变,线粒体皱缩,线粒体膜结构破坏,线粒体嵴错乱。Sesn2基因敲除小鼠DC细胞免疫功能降低;给予铁死亡抑制剂Lip-1后,DC免疫功能较对照组增强。小结:LPS(1μg/ml,24h)刺激Sesn2-/-小鼠DC细胞可诱导铁死亡发生,Sesn2蛋白对LPS刺激下DC细胞铁死亡发挥保护作用;Sesn2通过发挥对DC铁死亡的保护作用进而改善DC细胞免疫功能。第三部分Sestrin2对脓毒症小鼠树突状细胞铁死亡的保护作用目的:探讨Sestrin2对脓毒症小鼠脾脏DC铁死亡的保护作用及其免疫功能的影响。方法:采用WT小鼠和Sesn2-/-小鼠构建盲肠结扎穿孔术(CLP)脓毒症模型,并提取脾脏DC细胞。采用Fe、GSH、ROS比色法试剂盒通过荧光酶标仪检测细胞内含量;Western Blot技术分析DC中铁死亡相关蛋白表达水平;激光共聚焦观察DC细胞膜脂质过氧化水平;透射电镜观察DC细胞铁死亡发生后细胞形态及线粒体形态。分离WT和Sesn2-/-脓毒症小鼠脾脏进行组织染色,通过普鲁士蓝染色观察脓毒症小鼠脾脏组织铁沉积情况。同时,CLP术前1h给予两组小鼠腹腔注射铁死亡抑制剂(Lip-1)10mg/kg,检测DC细胞免疫功能及不同基因型小鼠的7d生存率。结果:Sesn2基因敲除小鼠CLP后铁死亡加重,DC细胞内GSH明显下降、Fe及ROS明显升高;x CT、GPX4表达降低,ACSL4、TFRC表达水平升高;DC细胞脂质过氧化程度加重;DC细胞线粒体形态改变,线粒体皱缩,线粒体膜结构破坏,线粒体嵴错乱,且脓毒症时脾脏组织形态学表现为亮蓝色染色和团块状分布。Sesn2-/-小鼠CLP中DC免疫功能较野生型小鼠明显降低。在CLP脓毒症模型术后24小时给予小鼠腹腔注射铁死亡抑制剂Lip-1,DC功能较单纯CLP组升高。小结:Sesn2蛋白敲除后脓毒症小鼠DC细胞铁死亡明显,Sesn2蛋白对脓毒症小鼠铁死亡发挥保护作用;且通过保护DC细胞铁死亡可进一步增强DC免疫功能。第四部分Sestrin2调控脓毒症状态下树突状细胞铁死亡的信号转导机制目的:深入探讨Sestrin2调控脓毒症脾脏DC细胞铁死亡的分子作用及信号转导机制。方法:分离WT及Sesn2-/-小鼠脾脏DC,给予LPS(1μg/ml)刺激24h,并于收集细胞前1h给予内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)ATF4-CHOP上游通路抑制剂(Salubrinal,Sal)20m M/L。采用Western Blot技术分析铁死亡相关蛋白及信号通路蛋白(ATF4、CHOP、CHAC1)表达水平;流式细胞术检测DC细胞表面分子表达水平;并检测T淋巴细胞增殖能力。结果:在体外给予LPS(1μg/ml,24h)刺激下,DC细胞机制通路蛋白ATF4、CHOP、CHAC1表达升高,Sesn2-/--LPS组较WT-LPS明显升高;给予内质网应激上游通路抑制剂Sal后,铁死亡现象较单纯LPS组缓解,x CT、GPX4表达升高,ACSL4、TFRC表达水平降低;LPS刺激前给予两组DC细胞Sal后,较单纯LPS刺激组DC免疫功能升高。小结:内质网应激相关通路ATF4-CHOP-CHAC1具有促进LPS刺激下DC细胞铁死亡的作用;Sesn2蛋白通过负向调控ATF4-CHOP-CHAC1的表达发挥对LPS刺激下DC细胞的保护作用。第五部分脓毒症患者血清铁死亡指标检测的相关研究目的:探讨早期脓毒症患者血清铁死亡相关指标的变化规律。方法:以2020年1月-2021年6月河北医科大学第二医院急诊科重症监护室收治的重症患者73例为研究对象,依据是否诊断为脓毒症分为非脓毒症组(32例)和脓毒症组(41例)。记录所有患者入院时基线资料、人口学特征、生命体征及实验室检查指标;计算两组患者入院时的急性生理学与慢性健康状况评分系统II(Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II,APACHE II)及序贯器官衰竭评分(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA)以评估病情严重程度;收集患者入院血液,离心后分别留取两组患者血液上清,采用Fe、GSH、ROS比色法试剂盒通过荧光酶标仪检测两组患者上清液中Fe2+、GSH、ROS含量,将上述指标进行相应比较及统计学分析。结果:脓毒症患者APACHE II及SOFA评分较非脓毒症患者明显升高,且脓毒症患者入院时血液上清GSH较非脓毒症患者降低、Fe及ROS含量显著升高。结论:脓毒症患者早期病程中氧化应激反应明显,存在铁死亡的可能性及风险。
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