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缺血性卒中是常见的脑血管病,由于其高发病率、高死亡率以及高致残率的特点,使之成为我国成年人致残的首位原因,所带来的全球卫生经济负担和家庭损失是不容忽视的。自1969年以来,学者们证实,高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是冠心病、卒中以及多种心血管疾病形成的一个可以改变的独立危险因素。越来越多的证据表明,血浆中Hcy的前体物质S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine,SAH)水平很有可能是比Hcy更为敏感的心血管疾病指示物。流行病学研究发现,脑卒中高危人群发生缺血性脑卒中的风险是非高危人群的数倍,并且吸烟、饮酒、体育锻炼等可改变的危险因素,对于脑卒中的发病、治疗及预后的意义更为重大。S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作为SAH在甲硫氨酸循环中的上游产物,血液中SAH和SAM含量的检测方法对于相关疾病的研究具有重要意义,已受到广泛关注。血液中的SAH和SAM在肾脏代谢重吸收,两种化合物在尿液中含量对于相关疾病的研究同样具有重要意义。目前尿液中SAH和SAM含量检测方法少有报道,尚缺乏一种准确、快速、简单的检测方法。大脑作为人体内耗氧量最高的器官,短时间的缺血缺氧即可造成神经元细胞发生不可逆的坏死。此种低氧微环境参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,对脑卒中等疾病的转归造成影响。SAH作为可能比Hcy更为敏感的心血管疾病指示物,其对于脑卒中发病的潜在作用机制尚不明确。因此,本研究首先通过人群研究,探究缺血性脑卒中的致病因子以及Hcy、SAH与脑血管损伤的关联性,阐明SAH作为缺血性脑卒中敏感筛查指标和治疗靶点的可行性。基于小分子离子对试剂三氟乙酸的运用,在优化了三种用于净化尿液样本的固相萃取小柱并阐述了相关机制后,建立了一种准确、快速、简单测定尿液中SAH和SAM含量的离子对色谱-固相萃取新方法,方法成功用于实际样品检测,为SAH和SAM的后续研究提供了技术支持。再者,利用氧-葡萄糖剥夺细胞模型,探究SAH在缺血性卒中发病中的凋亡相关机制,为进一步明确缺血性卒中的发病机理以及开展临床治疗提供理论依据和新的思路。主要内容如下:第一部分:S-腺苷同型半胱氨酸及其代谢产物与缺血性脑卒中发病的相关性研究目的:探究与缺血性脑卒中发病密切相关的致病因子,阐明Hcy、SAH作为潜在的导致脑微血管内皮损伤因素的关联性,明确SAH作为缺血性脑卒中筛查敏感性指标及治疗靶点的可行性。方法:本研究2018年6月至2019年10月间在河北省石家庄市河北医科大学第一医院招募健康个体240人、脑卒中高危个体143人和脑卒中患者189人为研究对象。通过开展问卷调查,并结合相应的体格检查和实验室检查手段,获取三组人群不良生活方式、既往慢性病史和家族史情况,以及常见临床指标信息,并测得与Hcy代谢密切相关的SAM、SAH等物质的构成与代谢差异情况。结果:通过对各组间研究对象进行性别、年龄匹配并且剔除信息缺失者后,最终将78例健康者、80例脑卒中高危者和88例脑卒中患者纳入统计分析中。BMI指数、腰臀比的测量结果显示,患者组及高危组人群的测量值均大于健康组人群(P<0.05)。患者组及高危组人群中吸烟者所占比例远高于健康组人群,两组中吸烟者人数超过健康组中吸烟人数的二倍(P<0.05)。健康组中有体育锻炼习惯的人数最多,且该项指标在三组人群中的分布情况具有显著的统计学差异(P<0.05)。婚姻状况及是否饮酒这两项指标在三组人群之间未见显著的统计学差异。三组研究对象的收缩压及舒张压测量结果表现为患者组>高危组>健康组(P<0.05)。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定结果表现为,健康组>高危组>患者组(P<0.05)。高危组的甘油三酯水平高于患者组和健康组(P<0.05)。患者组的血糖值略低于高危组和健康组(P<0.05)。超敏C反应蛋白的测定结果表现为,患者组>高危组>健康组(P<0.05)。高危组和患者组的尿酸均值明显高于健康组(P<0.05)。总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测定结果在三组人群之间未见显著的统计学差异。患者组内有高血压病史的人数最多,高危组次之,健康组内无高血压病史者(P<0.05)。健康组内无糖尿病史者,高危组内有糖尿病史者所占比例略高于患者组(P<0.05)。在既往有TIA发作的个体中,有17人属于患者组,14人属于高危组,健康组内无既往TIA发作的研究对象(P<0.05)。患者组中既往有脑卒中病史的人数远多于高危组和健康组(P<0.05)。高危组人群中有脑卒中家族史的个体数多于患者组和健康组(P<0.05)。患者组血浆中Hcy含量显著高于高危组和健康组,并且三组人群之间Hcy的含量存在显著的统计学差异(P<0.05)。健康组人群血浆中SAM的含量最高,高危组次之,患者组最低(P<0.05)。血浆中SAH含量在三组人群之间无显著的统计学差异(P>0.05)。SAM/SAH比值的结果表现为,患者组<高危组<健康组,且患者组与健康组之间的SAM/SAH存在显著的统计学差异(P<0.05)。小结:Hcy对脑卒中发病的危害性始终存在,SAH与缺血性脑卒之间的关系复杂且密不可分,仍需开展更进一步的调查研究以论证二者之间的确切联系。同时,对脑卒中高危人群的筛查和干预,将对降低脑卒中的发病率及改善预后起到重要影响。第二部分:尿液中S-腺苷同型半胱氨酸和S-腺苷甲硫氨酸检测新方法建立运用及其固相萃取机制研究摘要:目的:建立检测尿中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的离子对色谱新方法,研究检测SAH和SAM尿液样本的固相萃取相关机制。方法:考察了Elut PBA、Bond Elut PRS、Bond Elut CBA三种固相萃取小柱对尿液样本中SAH和SAM的萃取效果并研究了相关萃取机制。样品加入30%高氯酸沉淀蛋白,上清经最优的固相萃取小柱净化,洗脱液通过0.25μm滤膜过滤后收集于进样小瓶中备用。样品中的SAH和SAM经三氟乙酸作为离子对试剂的离子对色谱分离后在二极管阵列检测器完成检测。结果:确定Elut PBA为最佳的固相萃取小柱,并阐明了相关萃取机制。SAH和SAM在0.1-10μmol/L和0.5-60μmol/L范围内呈良好线性关系,回归方程分别为y=4.6492x-0.0718(R~2=0.9998)、y=9.4968x+0.8157(R~2=0.9999)。SAM和SAH的检测限(LOD)分别为0.01和0.006μmol/L,定量限(LOQ)分别为0.04和0.02μmol/L。SAM和SAH的日内和日间精度均低于1.38,回收率在83.65%至98.41%之间。小结:建立了一种测定尿中SAH和SAM的离子对色谱新方法,阐明了相关固相萃取机制,方法准确、快速、简单、经济,阐明的相关机制对SAM和SAH的其它研究具有一定的指导意义。方法成功运用于实际样品的测定,结果令人满意。第三部分:S-腺苷同型半胱氨酸在缺血性脑卒中发病中的凋亡相关分子机制研究目的:探究S-腺苷同型半胱氨酸诱导b.End3细胞凋亡的具体分子机制。方法:利用b.End3细胞构建氧-葡萄糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型,并在此基础上添加3-脱氮腺苷(3-deazaadenosine,3-DZA),使得b.End3细胞内SAH含量堆积。通过对细胞内总乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的检测及CCK-8比色法测定细胞存活率,来分析b.End3细胞受损情况。采用Annexin V-PI双染色流式细胞术测定不同干预组的细胞凋亡率。利用Western Blot免疫印迹法测定各处理组中凋亡相关蛋白以及信号通路有关蛋白的表达量情况。结果:根据不同接种密度时细胞的生长状态,确定以9*10~3个/100μl接种密度用于后续研究当中。根据不同氧-葡萄糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)时间导致细胞损伤的程度以及细胞存活率的结果,确定OGD 25小时为最适宜干预时长。LDH测定结果显示,与Con组相比,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组的LDH释放量均明显增加,并且各处理组之间LDH释放量依次增加,各组之间的释放量均存在显著的统计学差异(P<0.05)。细胞存活率测定结果显示,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组细胞存活率均显著下降,以3-DZA+OGD组的细胞存活率最低。在Annexin V-PI双染色流式细胞术测得的细胞凋亡率结果中,3-DZA+OGD组的总凋亡率显著高于其余处理组,并且各处理组间的总凋亡率存在显著的统计学差异(P<0.05)。Western blot实验结果显示,与Con组相比,3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组中Bcl-2/Bax蛋白的相对表达量均明显下降。促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白的相对表达量在3-DZA组、OGD组及3-DZA+OGD组中呈现依次增加的趋势。JNK信号通路蛋白p-JNK/JNK的相对表达量的趋势与Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白的表达趋势相一致。Western blot结果中各组间蛋白表达量的差异均存在显著的统计学差异(P<0.05)。添加阻断剂SP600125后,3-DZA+OGD+IN组细胞内LDH释放量要少于3-DZA+OGD组,并且前者的细胞存活率要显著高于后者(P<0.05)。流式细胞术对三组细胞凋亡率的测定结果表明,3-DZA+OGD+IN组细胞的总凋亡率显著低于3-DZA+OGD组(P<0.05)。3-DZA+OGD+IN组细胞中Bcl-2/Bax蛋白的相对表达量显著高于3-DZA+OGD组。促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3/Caspase-3蛋白以及信号通路蛋白p-JNK/JNK的相对表达量趋势一致,均表现为3-DZA+OGD+IN组中表达量低于3-DZA+OGD组的现象(P<0.05)。小结:SAH能够造成b.End3细胞损伤并导致b.End3细胞内凋亡率升高和相关促凋亡蛋白表达的升高以及抑凋亡蛋白表达的下降,通过对MAPK信号通路的三条重要分支通路的Western blot检测确定了SAH致凋亡的具体调控信号通路--JNK通路。进一步在回复实验的基础上明确了SAH通过JNK信号通路的激活得以诱导b.End3细胞内凋亡现象的发生。