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猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCo V）是新发现的以引起仔猪严重脱水、呕吐、消瘦、急性水样腹泻为主要临床特征的猪病毒性腹泻病原,属于冠状病毒科（Coronaviridae）、δ冠状病毒属（Coronavirus）成员。PDCo V在新生仔猪中有较高的感染率,患病猪剖检可见小肠绒毛出现严重萎缩,病毒主要在小肠内容物及粪便中检测到。目前已在美国、中国、越南、老挝等多个国家和地区发现有该病的流行。PDCo V的临床发病情况和解剖病理变化与猪流行性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE）较为相似,且常与它们发生混合感染。报道显示:猪氨基肽酶N（p APN）是猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的感染性受体,在非洲绿猴肾细胞（Vero）细胞上孵育一定量可溶性p APN能够促进PEDV的复制。为了确定p APN是否为PDCo V的感染性受体,本研究扩增并克隆了p APN全基因,分别在BHK-21、293T细胞和大肠杆菌内表达了p APN的胞外域p APN-C部分蛋白,免疫新西兰大白兔后制备了p APN多克隆血清;用PDCo V感染表达了p APN的293T和BHK-21细胞,设置TGEV为阳性对照。结果显示:表达有p APN的293T和BHK-21细胞能够感染PDCo V,且这种感染能够被p APN抗血清抑制;将抗血清作用于PDCo V敏感细胞ST细胞后进行接毒,3 h、12 h和24 h病毒的相对含量和TCID50均显著降低。从而推测p APN是PDCo V的一个感染性受体。具体试验内容如下:1.p APN真核表达质粒的构建及体外表达根据Gen Bank上p APN基因序列（ID:HQ824547.1）设计p APN检测引物和扩增全基因的引物。为了确定p APN在猪体内和细胞上的表达情况,本试验分别以实时荧光定量RT-PCR和普通RT-PCR进行检测。结果显示:p APN在猪肾脏、小肠组织和ST、LLC-PK细胞中高表达;接着从猪小肠组织中提取到p APN全基因并克隆至p MD18-T载体上,经测序正确后命名为p MD-18T-p APN;随后以其为模板扩增p APN的胞外区p APN-C,构建了p EGFP-N1-p APN-C真核表达载体,测序正确后将其转染至293T和BHK-21细胞内,在24 h时观察到大量绿色荧光;24 h时收取细胞后用实时荧光定量PCR检测转染组p APN的m RNA水平是空细胞和空载体组的15000倍;对样品进行WB检测,结果显示:p APN在转染组成功表达。2.p APN原核蛋白表达及多克隆抗体制备为了获得p APN重组蛋白并制备p APN的多克隆血清。本研究设计了一对扩增p APN-C的特异性引物,扩增并克隆p APN-C至原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒,经双酶切和正确测序后命名为:p ET-28a-p APN-C。随后,将其转入大肠杆菌BL21中,成功表达了大小约为53 k Da的重组蛋白p APN-C;对IPTG浓度优化后,在0.6 m M IPTG时表达量最高;对蛋白的溶解性分析显示:该重组蛋白主要以包涵体形式存在;用6 mol尿素溶液变性后再以2 mol尿素溶液复性,经纯化后重组蛋白浓度为2.6 mg/m L,且具有较高的纯度;将纯化的p APN-C重组蛋白与弗氏佐剂乳化后,四次免疫新西兰白兔后,分离血清获得了兔抗p APN多克隆血清,该血清5000倍稀释后与制备的p APN-C重组蛋白能够发生特异性结合;以制备p APN抗体100倍稀释为一抗检测到ST和LLC-PK1细胞上的天然受体蛋白,以间接免疫荧光的方法识别到了p APN表达在细胞膜上。说明制备的p APN多克隆抗体具有较好的反应原性。3.p APN及多克隆血清对PDCo V在细胞上增殖情况研究为了筛选PDCo V的非易感细胞,探索BHK-21和293T细胞是否能被PDCo V感染。我们将PDCo V（CH-01 P4）（MOI=1）接种到长满为单层的BHK-21细胞上,观察细胞病变情况,在72 h时收细胞,收取的样品在BHK-21细胞上连续传代3次,用RT-PCR方法检测PDCo V在BHK-21细胞上的感染情况。结果显示:3代连续培养液均检测不到PDCo V;以PDCo V（MOI=1）感染长满为单层的293T细胞,于感染48 h后以间接免疫荧光法检测PDCo V病原,一抗为:兔抗PDCo V N多克隆抗体;二抗:FITC标记的羊抗兔Ig G。结果显示:293T细胞接毒后检测不到PDCo V病原。说明BHK-21和293T细胞均是PDCo V的非易感细胞。为了确定BHK-21和293T细胞感染PDCo V的最适胰酶浓度。分别用0、0.1%、0.3%、0.7%、0.9%、1%的Pancreatin的胰酶培养细胞,观察细胞形态。结果显示:BHK-21和293T细胞最适胰酶浓度为0.5%Pancreatin。为了确定p APN对PDCo V在细胞上增殖的影响。本研究以PDCo V（MOI=2）感染转染了p APN的BHK-21和293T细胞,同时设置TGEV为指示病毒,以鼠抗PDCo V N多克隆血清、兔抗p APN多克隆抗体为一抗,Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠Ig G、FITC标记的羊抗兔Ig G为二抗检测PDCo V病原,结果显示:在表达有p APN的293T和BHK-21细胞上被PDCo V感染,未表达p APN的细胞不会感染PDCo V;说明:p APN介导PDCo V感染BHK-21和293T细胞。为了进一步确定p APN抗血清对PDCo V在ST细胞上增殖的影响。以p APN抗血清孵育长满为单层的ST细胞1 h,MOI=1的PDCo V进行感染,37℃,5%CO2条件下吸附1 h后更换含有p APN抗血清的培养液继续培养,分别在3 h、12 h和24 h后收取样品,冻融三次后以q RT-PCR方法检测PDCo V的含量;同时对样品进行TCID50测定,结果显示:p APN抗血清对于病毒的复制具有抑制作用,在12 h和24 h效果更明显。综上所述,本试验分别在293T、BHK-21细胞和大肠杆菌中表达了p APN蛋白,制备了兔p APN多克隆血清;用PDCo V分别感染表达了p APN的293T、BHK-21细胞,发现p APN能介导病毒的感染;抗p APN血清能够与PDCo V竞争p APN蛋白分子从而抑制PDCo V的增殖。推测p APN是PDCo V的一个细胞感染受体。这个结果为PDCo V的受体研究提供了研究基础,也为PDCo V的抗病毒药物筛选提供一定的思路。