呕吐毒素降解菌的筛选及其对呕吐毒素诱导猪肠上皮细胞损伤的缓解作用

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:clijunhan
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呕吐毒素(vomotoxin),又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),是世界范围内谷物和食物中最常见的霉菌毒素之一。人与畜摄入含DON的食物后引起一系列的中毒症状。猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)是防御外部刺激的第一道物理屏障,DON是第一个公认的对肠上皮细胞有促炎反应和免疫调节作用的毒素。本试验旨在筛选出能降解DON的菌株,构建DON-IPEC-J2细胞模型,研究所筛选出来的微生物对DON的降解作用以及缓解毒素对细胞增殖的影响。试验主要分为以下两部分:试验一:首先,收集猪、鸡、牛、羊等动物的粪便、土样、水样以及霉变的玉米等样品,以DON为唯一碳源,通过无机盐培养基富集初筛DON降解菌,通过平板分离纯化的方法对DON降解菌进行复筛,用酶联免疫反应(ELISA)试剂盒检测DON含量,计算降解率,对具有降解作用的菌株进行形态学观察、生理生化实验和16S r DNA序列鉴定。其次,对实验室保存的益生菌和DON共培养筛选具有降解作用的菌株。结果表明:从羊粪中筛选出一株具有DON降解能力的细菌,命名为YIV,该菌在48 h时对DON的降解率为48.97%。该菌株呈短杆状,能形成芽孢,革兰氏染色为阳性,8 h开始进入对数期,16 h进入稳定期,生理生化特征符合芽孢杆菌的基本特征。经16S r DNA分析鉴定和进化树同源性对比后,发现YIV菌株与蜡样芽胞杆菌的相似性为99%。同时,从实验室保存的菌种中发现酿酒酵母能降解DON,48 h时对DON的降解率为42.49%。试验二:探究DON、蜡样芽胞杆菌、酿酒酵母分别对IPEC-J2细胞增值的影响以及酿酒酵母和DON共培养对IPEC-J2细胞增殖和细胞因子m RNA表达量及细胞凋亡的影响。用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)检测不同浓度的DON及不同浓度蜡样芽胞杆菌和酿酒酵母在不同时间内对细胞增殖的影响。结果表明,DON对IPEC-J2细胞的增殖抑制呈现剂量—时间依赖效应,当DON浓度在0.15-19.2μg/m L时,可显著地抑制细胞的增殖(P<0.05),24 h时对细胞增殖的抑制率为16.19%-50.94%(P<0.05)。DON浓度为0.075、0.15、0.3、0.6、1.2μg/m L时,在8 h时对细胞增殖的抑制率分别为4.75%(P>0.05)及17.73%、10.99%、17.88%、21.89%(P<0.05),对LDH(乳酸脱氢酶)释放量较对照组分别增加7.14%(P>0.05)及146.43%、160.71%、182.14%、167.86(P<0.05),说明DON破坏IPEC-J2的细胞膜,增加细胞渗透性,对细胞有一定的损伤作用,所以选择以上五个DON浓度作用IPEC-J2细胞8 h进行下一步试验。研究发现,蜡样芽胞杆菌和细胞1:1培养8 h后显著降低了细胞的存活率(P<0.05),对细胞增殖抑制率为80.65%(P<0.05),故不进行后续试验。另一项研究表明,酿酒酵母和细胞1:1培养8 h对细胞的增殖有一定的促进作用(P>0.05),可以开展进一步的研究。在酿酒酵母与DON和细胞共培养时,研究酵母对DON的降解作用,以及缓解DON对细胞增殖的副作用;同时测定DON对细胞炎性因子IL-6、IL-10,趋化因子IL-8,紧密连接蛋白TJP和闭合蛋白Occuldin的表达作用。试验分为对照组、DON添加组(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2μg/m L),酿酒酵母添加组(添加量为细胞数量的1倍),酿酒酵母+DON(0.075、0.15、0.3、0.6、1.2μg/m L)添加组,在37℃和5%CO2条件下培养8 h。结果表明:酵母添加组比对照组细胞活力增加了44.83%(P<0.05);酿酒酵母+DON组与相应的DON添加组相比促进了细胞增殖(P>0.05),乳酸脱氢酶(LDH)释放量分别减少26.67%(P>0.05)及66.67%、69.86%、72.15%、68.00%(P<0.05),对DON的降解率分别为57.14%、46.15%、42.31%、26.67%、13.51%,但均差异不显著(P>0.05)。IL-6、IL-8、IL-10、TJP1、Occludin的表达量都随着DON浓度的升高有上调的趋势,酿酒酵母组和对照组比差异不显著;但是在高剂量DON添加组(1.2μg/m L),酿酒酵母的添加显著地提高了细胞IL-6、IL-8、IL-10的表达量(P<0.05),而降低了TJP和Occludin的表达量(P>0.05)。酿酒酵母与DON和细胞共培养时,研究酵母缓解DON对肠上皮细胞凋亡的作用。试验分为对照组,DON(1.2μg/m L)组,酿酒酵母组,酿酒酵母+DON(1.2μg/m L)组,共培养8 h后用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒及用流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果表明:DON组早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞较对照组分别增加了2.23倍和4.53倍(P<0.05);酵母组和对照组对比增加了早期和晚期凋亡细胞数(P>0.05),活细胞数有所降低,但是差异不显著(P>0.05)。酵母和DON共培养组与DON组相比,早期和晚期凋亡细胞分别下降了44.78%,46.37%(P<0.05),活细胞数增加了2.35%(P<0.05)。综上所述,酿酒酵母对DON具有降解作用,可缓解DON对猪肠道上皮细胞的损伤,保护了肠道细胞膜的完整性。
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