【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨HSCs外泌体源性circ WDR25对肝癌细胞侵袭增殖的作用及癌旁活化肝星状细胞（HSCs）与γδT淋巴细胞相互作用（二者比值）与肝细胞癌（HCC）根治性切除术后患者的预后关系。方法:肝星状细胞系LX-2分别与肝癌细胞系Hep3B、SMMC-7721、HCCLM3行transwell法共培养建立肿瘤活化的HSCs,基因芯片检测对比发现,circ WDR25显著上调,差异变化最
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目的:本研究旨在探讨HSCs外泌体源性circ WDR25对肝癌细胞侵袭增殖的作用及癌旁活化肝星状细胞（HSCs）与γδT淋巴细胞相互作用（二者比值）与肝细胞癌（HCC）根治性切除术后患者的预后关系。方法:肝星状细胞系LX-2分别与肝癌细胞系Hep3B、SMMC-7721、HCCLM3行transwell法共培养建立肿瘤活化的HSCs,基因芯片检测对比发现,circ WDR25显著上调,差异变化最明显,选择circ WDR25作为靶基因进行研究。利用慢病毒敲低LX-2中的circ WDR25后,通过梯度超速离心提取NC-LX-2-circ WDR25、sh-LX-2-circ WDR25细胞来源的外泌体。透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）观察外泌体的形态及分析其粒径和浓度、蛋白印迹实验（Western Blot,WB）鉴定外泌体表面标记物的表达。分别将NC-LX-2-circ WDR25与sh-LX-2-circ WDR25来源的外泌体与肝癌细胞Hep3B与SMMC-7721共培养后,采用细胞划痕实验、transwell小室迁移侵袭实验、CCK-8实验检测肝癌细胞迁移、侵袭以及增殖能力的变化。接着,选择320例癌旁肝组织行免疫组化,计算HSCs与γδT淋巴细胞比值,Kaplan Meier法进行生存分析,单因素分析、多因素分析比较与HCC根治性肝切除术后患者预后的关系。结果:利用肿瘤活化的HSCs进行基因芯片检测,发现circ WDR25（hsa-circ RNA-0004310）表达上调最显著;慢病毒转染LX-2后成功分离并鉴定NC-LX-2-circ WDR25、sh-LX-2-circ WDR25的外泌体。NC-LX-2-circ WDR25分离的外泌体与肝癌细胞Hep3B、SMMC-7721共培养后能促进Hep3B与SMMC-7721的迁移、侵袭及增殖能力。此外,免疫组织化学检测发现癌旁组织中HSCs的表达明显多于γδT淋巴细胞。利用X-tile软件计算出最佳截值为18,根据癌旁HSCs与γδT淋巴细胞比值将患者分为低比值组（比值≤18,n=222）和高比值组（比值>18,n=98）。多因素分析,术前白蛋白>40 g/L（HR=0.553,95%CI:0.371～0.824）、肿瘤多发（HR=1.895,95%CI:1.155～3.108）、微血管侵犯（HR=1.665,95%CI:1.104～2.512）、肿瘤直径>5 cm（HR=2.400,95%CI:1.603～3.594）、HSCs与γδT淋巴细胞比值>18（HR=1.880,95%CI:1.257～2.810）是总体生存率的独立危险因素。术前甲胎蛋白>20μg/L（HR=1.631,95%CI:1.151～2.311）、微血管侵犯（HR=2.145,95%CI:1.536～2.994）、肿瘤直径>5 cm（HR=1.866,95%CI:1.342～2.592）、HSCs与γδT淋巴细胞比值>18（HR=1.517,95%CI:1.084～2.122）是HSCs患者无瘤生存率的独立危险因素。癌旁HSCs与γδT淋巴细胞低比值组患者累积生存率和累积无瘤生存率均优于高比值组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:Circ WDR25在肿瘤活化的HSCs中呈显著高表达。下调LX-2中的circ WDR25后成功分离出外泌体,在体外能够抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖。HSCs和γδT细胞比值与HCC根治性切除术后患者总体生存率及无瘤生存率均呈负相关;
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