【摘 要】
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结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的慢性传染病,是全人类所面临的重大公共卫生问题之一。自九十年代起被批准上市的抗结核类药物仅有德拉马尼和贝达喹啉两种,迄今为止已出现关于副作用及耐药菌株出现的报道。因此,开发新型抗结核药物依然具有重要的意义。莽草酸途径（shikimate pathway）是存在于植物、细菌和真
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结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的慢性传染病,是全人类所面临的重大公共卫生问题之一。自九十年代起被批准上市的抗结核类药物仅有德拉马尼和贝达喹啉两种,迄今为止已出现关于副作用及耐药菌株出现的报道。因此,开发新型抗结核药物依然具有重要的意义。莽草酸途径（shikimate pathway）是存在于植物、细菌和真菌中的一条重要的代谢途径,该途径能够合成叶酸、萘醌、泛醌、分枝菌酸、芳香族氨基酸等必需物质。在结核分枝杆菌中,阻断莽草酸途径后菌的生长被抑制;此外,人体内莽草酸途径中各个酶的编码基因并不存在;也未有以该途径为靶标的抗结核药物应用于临床的报导,因此以莽草酸途径中关键酶为靶标的抗结核药物可能具有有效、低毒且无交叉耐药的优势。在本研究中,我们以莽草酸途径中的关键酶——莽草酸激酶（MtSK）为靶标进行抗结核先导化合物的筛选与相关机制的研究。课题组在前期工作中通过表型筛选和酶活性筛选获得了阳性化合物IMB-T5147,在本研究中进一步对该化合物的酶抑制活性和抗结核活性进行了检测。首先在E.coli原核系统中表达并纯化MtSK蛋白,建立基于ATP荧光的MtSK酶活抑制的评价方法,对化合物IMB-T5147进行抑制活性研究,结果发现化合物的酶抑制活性较高,IC50值为4.489 μ g/mL;然后建立基于HPLC技术的酶活检测方法,对IMB-T5147的酶活抑制机制进行了深入研究,结果发现随着莽草酸底物浓度增加,酶抑制活性降低,证明该化合物是莽草酸底物竞争性酶抑制剂;SPR技术检测发现IMB-T5147与MtSK蛋白的亲和力KD值为1.27×10-5 M;化合物IMB-T5147对哺乳动物细胞的毒性较低,在100μg/mL未见对HepG2细胞的生长抑制活性,IMB-T5147对结核分枝杆菌标准株H37Rv的MIC为31.25μg/mL。本研究也以MtSK的闭合型结构为靶标进行了抑制剂的虚拟筛选。首先通过分子对接软件AutoDock Vina对大型商业库进行虚拟对接,然后对打分在前1000的通过Dock6.7重新对接,最终选择前100个化合物作为第一批候选化合物;采用分子相似度筛选方法,获得第二批候选化合物86个;对两批化合物进行聚类分析,最终选择38个化合物进行后续研究。对候选化合物进行MtSK酶抑制活性评价,结果发现在20 μg/mL的时候,有5个化合物抑制率高于50%,它们对结核分枝杆菌标准株 H37Rv 的 MIC 是 62.5 μg/mL。总之,在本研究中首次评价了化合物IMB-T5147的酶抑制活性、细胞毒性和抗结核活性;应用AutoDock Vina与UCSF Dock 6.7软件联用法对大型商业库ChemDiv和TargetMol进行了抑制剂虚拟筛选,发现了 5个化合物,其浓度在20 μg/mL对MtSK的抑制率在50%以上的化合物,推动了靶向MtSK的抗结核药物的研究。
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