【摘 要】
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参照Ambion(Austin,TX,USA)和NipponBioService(Asaka,Saitama,Japan)公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具http:www.ambion.com/techlib/misc/siRNA design html
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参照Ambion(Austin,TX,USA)和NipponBioService(Asaka,Saitama,Japan)公司的成功的经验并利用Ambion公司的在线设计工具http:www.ambion.com/techlib/misc/siRNA design html,针对MDV-1 RBIB株UL49基因序列(编码被膜蛋白VP22)寻找siRNA靶序列,根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证,所选择的靶序列与鸡体和其他病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5′端开始的19个核苷酸为正义链,中间加入9个核苷酸TTCAAGAGA的间隔以形成发夹结构,3′端加有转录终止信号TTTTTT。并且5′端带有BamHI(GATCC)酶切位点,3′端带有Sal Ⅰ(GTCGAC)和Hind Ⅲ(TTCGA)酶切位点。靶序列分别被克隆到psilence2.0-U6载体上。经Sal Ⅰ酶切鉴定和测序鉴定后,证明已成功地构建了针对UL49基因不同区域的shRNA(small hairpin RNA)表达载体。分别被命名为pu6vp22-1、pu6vp22-2、pu6vp22-3、pu6vp22-4、pu6vp22-5、pu6vp22-6、pu6vp(阴性对照)。同时根据Ambion公司已发表的针对加强绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA序列构建了相应的阳性对照载体pu6EGFP。 以提取的MDV-1 RBIB株病毒基因组DNA为模板,根据Gene Bank上发表的MDV Md5株UL49基因序列设计1对特异性引物,扩增出UL49(750bp)基因,克隆到pMD18-T Simple Vector。目的片段经双酶切连接到pEGFPC1载体上,构建了pEGFP-vp22融合表达载体。经转染CEF细胞,分别在24h,48h,72h观察荧光的变化。发现转染后24h就可见到荧光,48h荧光最强,72h荧光逐渐减弱,减少;并随着时间的延长荧光发生变化,24h在胞浆和核内都有,48h主要集中在胞核区域,72h完全在核内。而对照pEGFP—C1转染的CEF细胞胞内充满荧光,随着时间的延长荧光数量逐渐减少。PEGFP-vp22与构建的针对UL49基因不同区域的shRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后,分别在24h,48h,72h观察荧光的变化,结果发现,共转染48h后与pu6vp22-1、pu6vp22-4质粒共转染的孔荧光均减弱,荧光细胞数减少,特别是与pu6vp22-4质粒共转染的孔,几乎看不到荧光的表达。在此基础上以内标法进行相对定量RT-PCR(反转录聚合酶链反应),在mRNA水平上来验证这些shRNA表达载体的有效性,结果表明pu6vp22-1、pu6vp22-4表达载体对VP22蛋白的抑制率分别是69%和93%。 选取能有效抑制MDV1型超强毒RB1B株的被膜蛋白VP22的shRNA表达载体—pu6vp22-4,通过转染CEF细胞后,再接种超强毒RB1B株,通过蚀斑数的比较来验
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