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本研究目的:
1.探索星形胶质细胞与乏氧组织分布的关系;
2.研究脑梗死后乏氧组织的动态变化与星形胶质细胞的关系。
3.研究脑梗死后乏氧组织的持续时间与星形胶质细胞的关系。
实验过程:
1、实验动物:
健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠43只,体重280~330g,清洁级,人工昼夜节律饲养。
2、缺血再灌注模型的制作:
参照Longer氏法,稍加改良。到缺血预定观察时间点后,将栓线拉回到ECA的主干中,从而实现再灌注。持续缺血组不拔线。假手术组不插线,其余操作同上。
3、实验分组:
分3组:1.5h缺血再灌注(1.5h IR)组、持续缺血(PI)组和假手术组(S组);1.5hIR组和PI组再分术后1d、3d、7d、14d四个亚组,每个亚组5只大鼠。S组共3只大鼠。
4、EF5和GFAP的免疫双标:
乏氧标记采用乏氧标记物2-(2-nitro—lH—imidazole-1-yl)—N—(2,2,3,3,3-pentafluoropropyl) Acetamide(简称EF5),由美国宾夕法尼亚大学的Cameron J Koch教授馈赠。采取胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)标记活化的星形胶质细胞。
1.5h IR组和PI组:在每个观察时间点,每只大鼠以EF5溶液(生理盐水溶解,3mg/ml)按1ml/100g体重的剂量从尾静脉注射进体内,4h后心脏灌注,迅速开颅取脑;OCT包埋后,以视交叉为中心间断连续冰冻切片,每隔0.5mm切一张片,每个组织共5张片。切片以4%多聚甲醛固定后,依次以0.3%TritonX100和10%山羊血清处理;以GFAP多克隆一抗(1:200稀释,由武汉博士德生物技术公司提供)4℃孵育过夜,ttPBS和PBS浸泡后再以FITC标记的二抗(1:50稀释,由武汉博士德生物技术公司提供)室温、避光孵育2h;接着以4%多聚甲醛室温、避光重新固定20min,ttPBS和PBS浸泡,以10%山羊血清重新封闭1h;ttPBS和PBS浸泡后,以Cy3标记的ELK3-51避光、4℃孵育过夜。ttPBS和PBS浸泡后,50%甘油封片。荧光显微镜下观察。乏氧组织呈红色荧光,GFAP呈绿色荧光。
S组不需静脉注射EF5溶液,仅进行GFAP染色。
5、组织分区:
将梗死侧大脑半球的周围皮质区依次分为A、B、C三个区(图2),显微镜下以×200的倍数进行观察。
6、图像分析及GFAP荧光强度计算方法:
利用Adobe Photoshop CS2专业图形分析软件对双标的乏氧图片和GFAP染色图片进行重叠(图层合并)。利用Image Pro Plus6.0专业图像分析软件对GFAP染色图片进行荧光强度计算。
7、统计学分析:
采用SPSS for Windows Ver.11.5统计软件包对数据进行统计学处理。结果用(-X±s)表示,P<0.05认为有统计学意义。
结论:
1、乏氧组织内部星形胶质细胞活化较周围区域明显,乏氧可能促进星形胶质细胞活化。
2、脑梗死后乏氧组织的长时间存在与星形胶质细胞密切相关。