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研究背景:宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)又称Asherman综合征,是严重威胁女性身心健康的常见生殖器官功能障碍性疾病。宫腔手术操作造成的子宫内膜基底层破坏是IUA形成的主要原因。由于宫腔手术的增加,IUA在我国的发病率逐年上升,现已经成为继发性不孕的第二大病因。宫腔镜去除宫腔粘连是较为主要的IUA治疗手段,然而对于部分中重度IUA患者,粘连复发及妊娠率低是目前临床治疗中亟待解决的问题。随着再生医学的发展,已经证实间充质干细胞在组织损伤修复中具有重要的作用。课题组前期研究证实自体月经血来源间充质干细胞(Menstrual blood-derived stromal cells,MenSCs)移植显著促进重度IUA患者子宫内膜再生和宫腔形态恢复,部分患者在内膜修复后成功妊娠。然而,宫内灌注MenSCs治疗的时效性有待提高,如何提高MenSCs的定植和治疗效率是干细胞治疗IUA临床转化需要解决的关键问题。富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是一种人工制备的外周静脉血衍生产品,富含多种生长因子,被证实具有促进细胞功能、与组织原有细胞外基质相互作用、调节干细胞微环境、利于细胞增殖和伤口愈合等作用。多种组织来源的间充质干细胞均在PRP处理后呈现增殖、分化和募集等功能促进现象。此外,PRP在激活后表现为液体-凝胶双相的动态纤维蛋白支架结构,足以在体内维持其较长时间的生物活性,并提高干细胞疗法中移植细胞的生物学效力,是理想的干细胞支架材料。因此本研究拟明确PRP对MenSCs的促进作用,探索PRP中的关键效应因子,在前期研究基础上利用大鼠IUA疾病模型探究MenSCs联合PRP移植对IUA的治疗作用,进一步探究MenSCs修复子宫内膜损伤的分子机制,从组织水平、细胞水平、分子水平多层次进行研究,对干细胞治疗子宫内膜损伤的新策略进行评价。研究方法:(1)利用体外细胞实验探索PRP对MenSCs生物学功能的促进作用,应用CCK8、免疫荧光、细胞化学和流式细胞术等技术明确PRP对MenSCs的调节作用;(2)利用动物实验探究MenSCs联合PRP移植对IUA的治疗有效性及作用机制,应用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western-blot等技术,从组织水平和分子水平检测治疗后IUA子宫内膜厚度、纤维化等病理指标改变情况及子宫内膜干细胞标志表达情况,初步阐述MenSCs改善子宫内膜损伤的分子机制;根据大鼠的妊娠率和活胎率考察MenSCs联合PRP移植对IUA模型大鼠生育力改善情况,明确PRP能够有效提高MenSCs对IUA的治疗效率;(3)利用临床样本进行体外细胞实验,应用CCK8、免疫荧光、流式细胞术和Western-blot技术明确PDGFBB是PRP作用于MenSCs的关键效应因子,并结合第二部分结果对MenSCs改善IUA子宫内膜的作用分子途径进行验证,进一步明确MenSCs对子宫内膜纤维化的逆转作用。研究结果:第一部分结果表明,激活的PRP对MenSCs的生物学功能具有正向调节作用。PRP能够显著促进MenSCs增殖,提高S期细胞比例,抑制体外培养相关的细胞凋亡,提高MenSCs标志SUSD2,CD146和CD105的表达,促进MenSCs成骨分化和成脂分化。第二部分结果表明,PRP对MenSCs治疗大鼠IUA模型具有协同作用。PRP联合移植显著提高MenSCs在IUA大鼠子宫内膜内的定植效率,提高子宫内膜干细胞标志PDGFR的表达。MenSCs联合PRP的治疗效果显著优于单独MenSCs移植或PRP注射,MenSCs联合PRP移植显著促进子宫内膜增殖,促进子宫内膜基质、腺体和血管再生,提高IUA大鼠子宫内膜CK18和CD31表达水平,改善子宫内膜纤维化减少胶原沉积,显著提高IUA大鼠的妊娠率和活产率;旁分泌作用可能是MenSCs治疗子宫内膜损伤的重要作用方式,PRP提高大鼠子宫内人源间充质干细胞分泌因子IGF-1、SDF-1和TSP-1基因表达水平;MenSCs治疗显著调节Hippo通路下游关键分子CTGF、WNT5A和GDF5的表达,PRP对MenSCs的通路调节作用具有促进效应。第三部分结果表明,与正常MenSCs相比,IUA患者的MenSCs中PDGFR呈低表达,外源性PDGFBB对IUA患者的MenSCs具有显著的正向调节作用,与第一部分PRP培养结果接近,PDGFBB促进MenSCs增殖和迁移,提高S期细胞比例,同时激活Akt/NFκB通路并提高P65表达及核转位。MenSCs的条件培养基显著降低IUA患者子宫内膜YAP及CTGF表达,PDGFBB预处理对此现象有促进作用。研究结论:1、本研究证实PRP对MenSCs的生物学功能具有促进作用,PRP与MenSCs具有协同效应;2、建立了MenSCs-PRP联合移植体系,明确PRP可以作为MenSCs移植辅剂提高MenSCs对IUA的治疗效率;3、发现Hippo通路可能是MenSCs逆转子宫内膜纤维化的重要分子途径;4、证实PDGFBB是PRP作用于MenSCs的关键效应因子,通过激活Akt/NFκB通路提高MenSCs生物学功能;5、明确旁分泌是MenSCs改善子宫内膜纤维化的重要作用方式。本研究初步阐明MenSCs修复子宫内膜损伤改善IUA的关键分子机制,明确PRP在干细胞治疗中的正向协同作用,为MenSCs联合PRP治疗IUA的临床应用提实验依据,为MenSCs治疗IUA的进一步临床推广奠定扎实的理论基础。