经血来源间充质干细胞联合富血小板血浆治疗大鼠宫腔粘连模型的有效性及作用机制研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cysyzcws
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研究背景:宫腔粘连(Intrauterine adhesion,IUA)又称Asherman综合征,是严重威胁女性身心健康的常见生殖器官功能障碍性疾病。宫腔手术操作造成的子宫内膜基底层破坏是IUA形成的主要原因。由于宫腔手术的增加,IUA在我国的发病率逐年上升,现已经成为继发性不孕的第二大病因。宫腔镜去除宫腔粘连是较为主要的IUA治疗手段,然而对于部分中重度IUA患者,粘连复发及妊娠率低是目前临床治疗中亟待解决的问题。随着再生医学的发展,已经证实间充质干细胞在组织损伤修复中具有重要的作用。课题组前期研究证实自体月经血来源间充质干细胞(Menstrual blood-derived stromal cells,MenSCs)移植显著促进重度IUA患者子宫内膜再生和宫腔形态恢复,部分患者在内膜修复后成功妊娠。然而,宫内灌注MenSCs治疗的时效性有待提高,如何提高MenSCs的定植和治疗效率是干细胞治疗IUA临床转化需要解决的关键问题。富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)是一种人工制备的外周静脉血衍生产品,富含多种生长因子,被证实具有促进细胞功能、与组织原有细胞外基质相互作用、调节干细胞微环境、利于细胞增殖和伤口愈合等作用。多种组织来源的间充质干细胞均在PRP处理后呈现增殖、分化和募集等功能促进现象。此外,PRP在激活后表现为液体-凝胶双相的动态纤维蛋白支架结构,足以在体内维持其较长时间的生物活性,并提高干细胞疗法中移植细胞的生物学效力,是理想的干细胞支架材料。因此本研究拟明确PRP对MenSCs的促进作用,探索PRP中的关键效应因子,在前期研究基础上利用大鼠IUA疾病模型探究MenSCs联合PRP移植对IUA的治疗作用,进一步探究MenSCs修复子宫内膜损伤的分子机制,从组织水平、细胞水平、分子水平多层次进行研究,对干细胞治疗子宫内膜损伤的新策略进行评价。研究方法:(1)利用体外细胞实验探索PRP对MenSCs生物学功能的促进作用,应用CCK8、免疫荧光、细胞化学和流式细胞术等技术明确PRP对MenSCs的调节作用;(2)利用动物实验探究MenSCs联合PRP移植对IUA的治疗有效性及作用机制,应用免疫组化、免疫荧光、RT-PCR、Western-blot等技术,从组织水平和分子水平检测治疗后IUA子宫内膜厚度、纤维化等病理指标改变情况及子宫内膜干细胞标志表达情况,初步阐述MenSCs改善子宫内膜损伤的分子机制;根据大鼠的妊娠率和活胎率考察MenSCs联合PRP移植对IUA模型大鼠生育力改善情况,明确PRP能够有效提高MenSCs对IUA的治疗效率;(3)利用临床样本进行体外细胞实验,应用CCK8、免疫荧光、流式细胞术和Western-blot技术明确PDGFBB是PRP作用于MenSCs的关键效应因子,并结合第二部分结果对MenSCs改善IUA子宫内膜的作用分子途径进行验证,进一步明确MenSCs对子宫内膜纤维化的逆转作用。研究结果:第一部分结果表明,激活的PRP对MenSCs的生物学功能具有正向调节作用。PRP能够显著促进MenSCs增殖,提高S期细胞比例,抑制体外培养相关的细胞凋亡,提高MenSCs标志SUSD2,CD146和CD105的表达,促进MenSCs成骨分化和成脂分化。第二部分结果表明,PRP对MenSCs治疗大鼠IUA模型具有协同作用。PRP联合移植显著提高MenSCs在IUA大鼠子宫内膜内的定植效率,提高子宫内膜干细胞标志PDGFR的表达。MenSCs联合PRP的治疗效果显著优于单独MenSCs移植或PRP注射,MenSCs联合PRP移植显著促进子宫内膜增殖,促进子宫内膜基质、腺体和血管再生,提高IUA大鼠子宫内膜CK18和CD31表达水平,改善子宫内膜纤维化减少胶原沉积,显著提高IUA大鼠的妊娠率和活产率;旁分泌作用可能是MenSCs治疗子宫内膜损伤的重要作用方式,PRP提高大鼠子宫内人源间充质干细胞分泌因子IGF-1、SDF-1和TSP-1基因表达水平;MenSCs治疗显著调节Hippo通路下游关键分子CTGF、WNT5A和GDF5的表达,PRP对MenSCs的通路调节作用具有促进效应。第三部分结果表明,与正常MenSCs相比,IUA患者的MenSCs中PDGFR呈低表达,外源性PDGFBB对IUA患者的MenSCs具有显著的正向调节作用,与第一部分PRP培养结果接近,PDGFBB促进MenSCs增殖和迁移,提高S期细胞比例,同时激活Akt/NFκB通路并提高P65表达及核转位。MenSCs的条件培养基显著降低IUA患者子宫内膜YAP及CTGF表达,PDGFBB预处理对此现象有促进作用。研究结论:1、本研究证实PRP对MenSCs的生物学功能具有促进作用,PRP与MenSCs具有协同效应;2、建立了MenSCs-PRP联合移植体系,明确PRP可以作为MenSCs移植辅剂提高MenSCs对IUA的治疗效率;3、发现Hippo通路可能是MenSCs逆转子宫内膜纤维化的重要分子途径;4、证实PDGFBB是PRP作用于MenSCs的关键效应因子,通过激活Akt/NFκB通路提高MenSCs生物学功能;5、明确旁分泌是MenSCs改善子宫内膜纤维化的重要作用方式。本研究初步阐明MenSCs修复子宫内膜损伤改善IUA的关键分子机制,明确PRP在干细胞治疗中的正向协同作用,为MenSCs联合PRP治疗IUA的临床应用提实验依据,为MenSCs治疗IUA的进一步临床推广奠定扎实的理论基础。
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