论文部分内容阅读
目的:甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）作为最常见的内分泌恶性肿瘤,近年来发病率逐渐升高。虽然绝大多数PTC患者的预后较好,但发生淋巴结转移或远处转移的患者不在少数,因此,探索并研究与PTC侵袭转移相关的具体分子机制尤为重要。泛素-蛋白酶体途径是细胞内调节蛋白降解等生理功能的重要分子机制。其中,泛素E3连接酶具有识别底物的特异性,在整个泛素-蛋白酶体途径中发挥至关重要的作用。泛素E3连接酶表达和功能的改变能够影响多种恶性肿瘤的发生发展。Deltex（DTX）家族蛋白（DTX1、DTX2、DTX3、DTX3L和DTX4）作为重要的泛素E3连接酶,通过特异性识别底物,调节泛素-蛋白酶体途径,从而参与多种细胞生物学功能过程。目前为止,在人类多种恶性肿瘤中均发现DTX家族蛋白的异常表达。然而,DTX3在PTC侵袭转移中的作用、影响和具体分子机制尚不清楚。本课题针对DTX3在PTC侵袭转移中具体作用及下游分子调控机制进行了深入研究和探讨。研究方法:1、分析肿瘤基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据库,比较DTX3在人体多种癌症和对应癌旁组织中的表达情况。收集114例PTC患者的癌组织和癌旁2cm以外的甲状腺正常组织,应用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）以及蛋白印迹（western blot）检测PTC组织和配对癌旁正常组织中DTX3的m RNA及蛋白表达情况,并分析DTX3在PTC中的表达水平与患者临床病理特征之间的关系。2、培养甲状腺上皮细胞系Nthyori3-1以及PTC细胞系K1和TPC-1,western blot及q RT-PCR检测并比较上述三种细胞中DTX3蛋白及m RNA的表达水平。通过细胞核和细胞浆分离提取及western blot实验检测DTX3蛋白在K1和TPC-1细胞中的表达定位情况。通过质粒转染,敲减K1和TPC-1中DTX3基因的表达,通过慢病毒转染,上调K1和TPC-1中DTX3基因的表达,分别筛选稳定转染细胞株。分别通过3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium（MTS）、划痕实验、Transwell侵袭实验、Annexin V-PE/7-amino-actinomycin D（7-AAD）双染实验和碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）染色实验检测DTX3表达改变对PTC细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。3、Western blot检测DTX3表达改变对上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关的E钙粘附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及N钙粘附蛋白（N-cadherin）的表达影响,并检测信号分子磷酸化-AKT（phosphorylated-AKT,p-AKT）和AKT蛋白的表达水平来评估DTX3表达改变对AKT信号通路的影响。接下来,通过免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）联合质谱技术（mass spectrometry,MS）筛选DTX3的互作蛋白,通过免疫荧光、体内泛素化实验和western blot鉴定DTX3可能的泛素化底物。结果:1、检索并比较TCGA数据库的结果表明,DTX3在人体多种原发癌症中呈现低表达,在甲状腺癌中的低表达尤为显著（p<0.05）。Western blot和q RTPCR结果显示PTC组织中DTX3蛋白及m RNA相对表达量明显低于癌旁组织（p<0.05）;且其在PTC中的低表达与患者发生颈部淋巴结转移密切相关（p<0.05）。2、Western blot和q RT-PCR结果显示,与Nthy-ori3-1相比,PTC细胞K1和TPC-1中DTX3蛋白及m RNA相对表达水平明显降低（p<0.05）。细胞核和细胞浆分离提取及western blot实验结果表明DTX3蛋白在K1和TPC-1细胞主要表达定位于细胞核。Western blot和q RT-PCR结果提示:与空白对照组（con）和敲减空载体组（neg-sh RNA）相比,敲减组（DTX3-sh RNA）中DTX3蛋白及m RNA的相对表达水平明显降低（p<0.05）,而con组和neg-sh RNA组间差异无明显统计学意义（p>0.05）;与con组和过表达空载体组（neg-vector）相比,过表达组（DTX3-c DNA）中DTX3蛋白及m RNA的相对表达水平明显升高（p<0.05）,而con组和neg-vector组间差异无明显统计学意义（p>0.05）。划痕实验结果提示DTX3能够抑制PTC细胞的迁移能力:DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞的划痕后平均细胞迁移面积百分比明显低于neg-vector组及con组（p<0.05）,而con组和neg-vector组间差异无统计学意义（p>0.05）;DTX3-sh RNA组中K1和TPC-1细胞的划痕后平均细胞迁移面积百分比明显高于neg-sh RNA组及con组（p<0.05）,而con组和neg-sh RNA组间差异无统计学意义（p>0.05）。Transwell侵袭实验结果表明DTX3会减弱PTC细胞的侵袭能力:DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞的平均侵袭细胞数明显少于neg-vector组及con组（p<0.05）,而con组和neg-vector组间差异无统计学意义（p>0.05）;DTX3-sh RNA组中K1和TPC-1细胞的平均侵袭细胞数明显多于neg-sh RNA组及con组（p<0.05）,而con组和neg-sh RNA组间差异无统计学意义（p>0.05）。MTS实验、Annexin V-PE/7-AAD双染实验及PI染色实验结果显示DTX3对PTC细胞的增殖能力、细胞凋亡和细胞周期无明显影响（p>0.05）。3、western blot结果提示DTX3会干扰PTC细胞发生EMT过程:DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞的vimentin蛋白相对表达水平明显低于negvector组及con组（p<0.05）;DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞的E-cadherin蛋白相对表达水平明显高于neg-vector组及con组（p<0.05）;K1和TPC-1细胞中N-cadherin蛋白相对表达水平在con、neg-vector及DTX3-c DNA三组间差异无明显统计学意义（p>0.05）;DTX3-sh RNA组中K1和TPC-1细胞的vimentin蛋白相对表达水平明显高于neg-sh RNA组及con组（p<0.05）;DTX3-sh RNA组中K1和TPC-1细胞的E-cadherin蛋白相对表达水平明显低于neg-sh RNA组及con组（p<0.05）;K1和TPC-1细胞中N-cadherin蛋白相对表达水平在con、neg-sh RNA及DTX3-sh RNA三组间差异无明显统计学意义（p>0.05）。除此之外,western blot结果表明DTX3对AKT信号通路有调控作用:DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞的p-AKT蛋白相对表达水平明显低于neg-vector组及con组（p<0.05）;而AKT蛋白相对表达水平在con、neg-vector及DTX3-c DNA三组间差异无明显统计学意义（p>0.05）;DTX3-sh RNA组中K1和TPC-1细胞的p-AKT蛋白相对表达水平明显高于neg-sh RNA组及con组（p<0.05）;而AKT蛋白相对表达水平在con、negsh RNA及DTX3-sh RNA三组间差异无明显统计学意义（p>0.05）。IP-MS实验中共鉴定出46个可能与DTX3发生相互作用的蛋白。经过进一步Co-IP实验检测,X射线修复交叉互补蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein 5,XRCC5）和NADH:泛醌氧化还原酶复合物组装因子5（NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 5,NDUFAF5）证实为DTX3的互作蛋白。免疫荧光实验结果表明DTX3与XRCC5在K1和TPC-1细胞核内存在蛋白表达的共定位。体内泛素化实验结果表明,DTX3-c DNA组中K1和TPC-1细胞内发生泛素化的XRCC5要明显高于neg-vector组（p<0.05）,说明DTX3能够促进XRCC5发生泛素化。结论:1、DTX3的蛋白和m RNA在PTC组织中的表达均明显低于癌旁组织,并且与PTC发生颈部淋巴结转移密切相关。2、DTX3能够明显抑制PTC细胞的迁移和侵袭能力,说明DTX3在抑制PTC发生侵袭转移的过程中产生重要影响。3、DTX3可能通过促进XRCC5发生泛素化、减弱AKT信号通路传导和抑制EMT过程的发生,以发挥对PTC迁移和侵袭能力的限制作用。