【摘 要】
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O-GalNAc糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,不仅在蛋白质加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程中具有重要功能,还在重组蛋白类药物修饰中具有重要意义,如缺乏糖基化修饰会缩短重组蛋白药物的体内半衰期或降低药效。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41）是催化蛋白
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O-GalNAc糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,不仅在蛋白质加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程中具有重要功能,还在重组蛋白类药物修饰中具有重要意义,如缺乏糖基化修饰会缩短重组蛋白药物的体内半衰期或降低药效。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41）是催化蛋白质O-GalNAc糖基化修饰的起始糖基转移酶,是调控人体蛋白质发生O-糖基化修饰及其糖蛋白生物功能的关键酶。体外高产量获得人源ppGalNAc-T酶对于重组治疗性O-糖蛋白药物的合成,疫苗生产及工具酶的开发都具有重要意义。由于ppGalNAc-T从进化上只存在于真核后生动物中,在细菌和酵母中不存在可以取代的同功酶。长期以来人们只能通过化学合成多肽的方式来取得O-GalNAc修饰糖肽,但对于大分子蛋白药物的O-糖链合成仍存在局限。利用昆虫细胞或人源HEK 293T细胞表达ppGalNAc-T酶存在表达量低、培养成本高等问题,无法适应日益增长的多肽蛋白类药物生产的需求。而过往在利用原核系统表达人源ppGalNAc-T酶时存在需要多个分子伴侣共表达帮助该酶折叠而导致表达效率低等问题。因此,本研究我们开发了一种可以获得产量达12 mg/L以上并具有稳定酶活的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统。本研究使用了Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS作为表达菌株,通过在该菌株胞内共表达人源蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide-isomerase,PDI,EC:5.3.4.1）,成功从大肠杆菌中表达纯化了高酶活的ppGalNAc-T酶。本论文主要内容和研究结果如下:（1）建立了一种操作简便、表达量高以及酶活强的大肠杆菌表达ppGalNAc-T酶的方法。研究发现在Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS菌株胞内共表达人源重组PDI和ppGalNAc-T酶,可以帮助ppGalNAc-T酶二硫键形成并且正确折叠。以ppGalNAc-T2酶为例,经过表达条件优化后可以从1 L培养基中获得超过12 mg的有活性的ppGalNAc-T2酶。（2）利用基于HPLC的酶动力学实验、圆二色谱实验等实验,我们系统性比较了E.coli和HEK 293T细胞表达系统生产的ppGalNAc-T2酶之间的差异。发现E.coli-T2和293T-T2针对受体底物EA2多肽和供体底物UDP-GalNAc具有相似的Vmax,但是E.coli-T2相比293T-T2对EA2和UDP-GalNAc的亲和力更强。圆二色谱结果表明,E.coli-T2具有和293T-T2相似的热稳定性,但是二者的α螺旋结构存在轻微差异。（3）利用体外酶法合成及点突变技术,我们证实大肠杆菌表达的ppGalNAc-T2酶可以选择性的在白介素-2（Interleukin-2,IL-2）蛋白T23位点上进行O-GalNAc糖基化修饰。该结果一方面验证了大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶的活性,同时为理解ppGalNAc-T酶精密调控底物蛋白糖基化的机制提供实例。综上所述,本研究中我们通过PDI共表达等方法构建了一种新型的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统,该系统操作简便,可以生产大量有活性的ppGalNAc-T酶。以IL-2为例,我们证实这种大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶能够用于体外催化蛋白上O-GalNAc糖链合成。本研究为体外合成均一化的O-糖蛋白药物提供了新的技术支持,同时相似的策略可以用来尝试表达其他的糖基转移酶。
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