论文部分内容阅读
DNA甲基化是一种在真核生物中保守的重要表观遗传修饰。植物中的DNA甲基化可以由RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)通路来建立。RdDM通路需要小RNA (small RNA, sRNA)的介导以及植物中特有的两种依赖于DNA的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase) Pol Ⅳ和Pol Ⅴ的共同参与。Pol Ⅳ和Pol Ⅴ与经典的RNA聚合酶Pol Ⅱ同源。Pol Ⅳ转录本被依赖于RNA的RNA聚合酶2(RNA dependent RNA polymerase 2, RDR2)和Dicer类似蛋白3(Dicer-like protein 3, DCL3)加工形成24个核苷酸(nucleotide, nt)长度的异染色质相关的小干扰RNA (heterochromatic small interfering RNA, hc-siRNA),在细胞质中与ARGONAUTE4 (AGO4)蛋白组装形成RNA沉默复合物(RNA-Induced Silencing Complex, RISC)。该沉默复合物随后被转运进入细胞核内,由siRNA靶向介导其与Pol Ⅴ转录本的结合,并招募DNA甲基转移酶2(Domains Rearranged Methyltransferase 2, DRM2)建立与hc-siRNA互补DNA的甲基化修饰。为了发现参与RdDM通路的新因子,我们利用拟南芥AG04自身启动子驱动表达的融合绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)的AG04转基因系,建立了有效针对RdDM通路的正向遗传学筛选体系。当RdDM通路发生缺陷导致hc-siRNA的水平降低时,AG04蛋白的稳定性下降,从而转基因系中GFP-AGO4的荧光信号将相应减弱。通过诱变筛选,我们从该体系中获得了68个AG04蛋白稳定性下降(defective in AGO4 stability, das)的突变体,其中包括65个RdDM通路已知组分的突变体和3个新突变体。本研究中,我们主要对dasl和das2两个新突变体进行分析。在dasl和das2突变体中,24-nt hc-siRNA的积累以及RdDM靶标位点的DNA甲基化在全基因组水平大幅下降,说明DAS1和DAS2是RdDM通路的必需组分。我们进一步分析发现,dasl和das2突变体中受影响的位点与Pol Ⅳ和Pol Ⅴ的最大亚基突变体nrpd1和nrpe1所影响的位点几乎完全重叠,暗示DAS1和DAS2可能是通过调控Pol Ⅳ和Pol Ⅴ的功能而参与RdDM的。图位克隆显示,DAS1和DAS2分别编码MINIYO(IYO)和QUATRE-QUART2 (QQT2),它们在动物和酵母中的同源物均被发现为PolII复合物的附属组分,且QQT2在酵母中的同源物Npa3被认为作为分子伴侣参与Pol Ⅱ的组装。通过生化实验,我们发现IYO和QQT2在拟南芥细胞中能够与RNA聚合酶的多个亚基相互作用,包括Pol Ⅱ、Pol Ⅳ和Pol Ⅴ共有的第三、第十和第十一亚基。通过进一步研究我们发现,das1/iyo和das2/qqt2突变体中,Pol Ⅴ全酶复合物并不完整,核心催化亚基NRPE1与其它亚基之间的结合程度显著下降,说明IYO和QQT2参与Pol Ⅴ的组装。与此相一致,我们发现das1/iyo和das2/qqt2突变体中NRPE1蛋白的积累量明显降低,NRPE1在细胞核中的分布减少,进一步说明IYO和QQT2的功能缺失导致Pol Ⅴ不能组装,进而使得核心催化亚基NRPE1易于降解且不能顺利入核。本研究鉴定了RdDM通路的两个全新因子IYO和QQT2,并证明它们通过调节Pol Ⅴ的组装而参与RdDM通路,揭示了RdDM通路中新的调控层面。此外,Pol Ⅴ与Pol Ⅱ、Pol Ⅳ在组成上高度相似,它们共用大部分亚基,未来进一步阐明植物中IYO和QQT2参与Pol Ⅴ组装的机制,将有助于我们认识真核生物中其它RNA聚合酶的组装过程。