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非编码RNA(Non-coding RNAs)是指存在细胞生命活动中不编码蛋白质的一类RNA。常见的具调控作用的非编码RNA包括si RNA,mi RNA,pi RNA和长链非编码RNA(lnc RNA)。生物体内非编码RNAs的稳定对于植物的生长、发育、分化都有重要的作用。在真核生物中小RNA的尿苷化是一个保守的RNA修饰过程,该过程与小RNA的降解相关。小RNA甲基化酶HEN1(HUA ENHANCER1)可以引起mi RNA或si RNA的2′-O-甲基化,保护小RNAs不被截短或尿苷化,这是小RNAs合成途径中的普遍现象。在hen1突变体中mi RNA的3′端被剪切或者尿苷化,且丰度降低,说明细胞中存在引起小RNA尿苷化的核酸转移酶,而且尿苷化引起小RNAs的降解。为了鉴定引起小RNAs尿苷化的酶,我们利用反向遗传学的方法在拟南芥中找到10个可能编码核酸转移酶的基因,并对这10个基因的功能展开研究。前期的研究发现在这10个基因中,只有HESO1功能缺失能部分恢复hen1突变体中的表型缺陷,对hen1heso1植株和hen1植株进行高通量测序,发现在hen1背景下,heso1的突变使得mi RNA的尿苷化现象明显减少且mi RNA的量增多。说明HESO1是主要负责mi RNA加尾的酶,在hen1突变体中负责小RNAs的尿苷化,mi RNA的尿苷化会导致其降解。但是,尽管heso1-1是无效等位基因,在hen1-8 heso1-1双突变体中仍然检测到一定水平的mi RNA尿苷化现象,说明拟南芥中还有其它的核酸转移酶具有使mi RNA加尾的功能。我们接着对剩下的9个基因的加尾功能进行研究,发现其中一个被命名为UTR1(RNA URIDYLYLTRANSFERASE 1)基因(At2g45620)突变,也会降低一些mi RNA的加尾现象,URT1也具有使mi RNA尿苷化的功能。URT1和HESO1对mi RNA底物的偏好不同,它们利用各自独特的功能协同合作,共同完成mi RNA的降解。其余的8个HESO1与UTR1的同源基因,我们称为NTP(NUCLEOTIDYL TRANSFERASE PROTEIN)基因。前面的研究显示这8个NTP基因对mi RNA没有显著的加尾功能,那么它们是否对si RNA具有加尾功能呢?于是我们对这8个NTP基因与HEN1基因的双突变体分别进行si RNA的高通量测序分析,发现其中一个基因,NTP6突变后植物内源24-nt si RNA的量明显升高,显示NTP6基因影响植物内源24-nt si RNA的水平,那么,我们推测NTP6是否参与植物内源24-nt si RNA的合成过程。24-nt si RNA是RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation,Rd DM)途径中的关键因子,Rd DM是植物中一种重要的甲基化方式。Rd DM途径主要有两个阶段:24-nt si RNA的产生和si RNA指导的DNA甲基化及转录水平的基因沉默(TGS)。拟南芥中有3种依赖DNA的RNA聚合酶(Pol II,Pol IV,Pol V)参与si RNA的生物合成以及si RNA指导的TGS。Pol IV在沉默位点转录出一条单链的长非编码RNA,由RDR2催化生成双链RNA。形成的双链被DICER-LIKE 3(DCL3)切割成24 nt的si RNA。24 nt的si RNA被甲基转移酶HEN1(HUA ENHANCER1)甲基化修饰后,进一步被AGO(ARGONAUTE)蛋白包裹、组装成si RNA/AGO4(AGO6)沉默复合体RISC(RNA-induced silencing complex)。聚合酶Pol V在si RNA位点转录产生一段支架RNA,进一步募集RISC,随后DNA甲基转移酶DRM2被募集到沉默位点后对DNA进行甲基化修饰。根据实验室前期研究结果,NTP6基因的突变可以导致拟南芥内源24nt si RNA的丰度升高,推测NTP6参与植物内源24-nt si RNA的合成过程。通过进化树分析,我们发现AT3g51620(NTP6)、AT3g56320(NTP7)、AT3g61690(NTP8)和AT2g40520(NTP2)这4个候选基因位于同一个分支,它们可能存在基因冗余现象。所以,本课题对这4个候选基因的功能开展研究,以期揭示它们在24-nt si RNA的合成过程以及Rd DM途径中所发挥的作用。本课题通过T-DNA插入法使NTPs基因突变,获得ntp2,ntp6,ntp7,ntp8等四种基因的单突变株,通过遗传杂交获得ntp2ntp6,ntp6ntp7,ntp7ntp8,ntp6ntp8双突变株。分别利用实时荧光定量PCR和Mcr BC-PCR的方法比较野生型(COL)和ntps单突变株和双突变株中Rd DM位点的基因的表达量和DNA甲基化水平的变化,研究结果发现ntps突变株中Rd DM部分位点基因的表达量降低,DNA甲基化水平有所升高。说明NTPs在Rd DM途径中起负调控作用,推测NTPs可以促进24-nt si RNA合成途径中非编码RNA的尿苷化影响植物内源24-nt si RNA的水平,从而通过Rd DM途径影响Rd DM位点DNA甲基化水平和基因的表达。实验结果表明NTP2、NTP6、NTP7和NTP8影响24-nt si RNA的合成过程以及在Rd DM途径中发挥一定的作用。