论文部分内容阅读
异戊烯基转移酶(Isopentenyl-Transferasas，IPT)，也称作细胞分裂素合成酶，是植物中细胞分裂素合成的限速酶。IPT基因在转基因植株中超表达后，会使叶片中的分裂素含量增加，从而延缓叶片衰老。但过高对植物的生长和育性都是有害的。如果将衰老特异性启动子(PSAG12)与IPT基因融合，在它的驱动下表达，只有在叶片衰老时才表达合成分裂素既能延缓衰老又不影响植物的生长发育。本研究的目的是探讨PSAG12与IPT基因融合后导入辣椒能否延缓辣椒的衰老，同时选用磷酸甘露糖异构酶基因PMI作选择基因，取代具有生态风险的抗生素抗性基因，为辣椒高产育种奠定基础。
1、载体构建在实验过程中，我们利用了pCAMBIA1301-PMI载体和SG516两个载体构建了植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-SG516。根据载体上的酶切位点，我们用XbaⅠ及NcoⅠ酶切pSG516，回收小片段得到片段ipt-nos，然后用PstⅠ酶切大片段得到启动子SAG12。用XbaⅠ和PstⅠ双酶切pCAMBIA1301-PMI回收大片段。用连接酶将三片段进行连接，转化大肠杆菌DH5a。进行蓝白斑筛选。然后对白斑进行质粒提取并分别用PstⅠ和EcoRⅠ进行酶切检测。得到含有目的片段的菌株后，保存菌种，提取质粒并转化农杆菌菌株LBA4404。
2、再生体系的建立用Flamingo-bill将培养12天的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽全部切去，只留一侧子叶作外植体进行再生体系的研究。表明生长调节物质和培养基的形式对非伤口接触培养基的外植体的分化与伸长影响不大，得到伸长芽只需20天，且其伸长率为90％。而对于伤口接触培养基的外植体于分化培养基上培养则会产生叶状的不正常芽，且生长缓慢。
3、遗传转化对农杆菌的浸染和转化过程进行了研究，用液体培养基(MS+蔗糖30g)进行2天预培养和5～7天共培养。随后于伸长筛选培养培养基（MS+琼脂4g／L+蔗糖20g／L+甘露糖20g／L+cb400mg／L）中进行20天培养，在生根培养基（MS+琼脂4g／L+蔗糖20g／L+甘露糖20g／L+IAA1.0mg／L+cb300mg／L）中进行20天培养。当幼苗长至3-4cm高时，移栽至营养钵。整个过程仅需两个月。
本研究共得到抗性植株545株。其中在最后一批次的植株中，一共225个外植体，共获得82株抗性植株，PCR检测的阳性率约为70%。而在对T1代的PCR检测表明该基因能稳定遗传给下一代。
本实验还对转基因植株的性状进行了初步观察。转化植株具有叶片衰老延缓及植株生命周期延长等现象，花的衰老也有所延缓，种子萌发明显延迟等。从T1的株高和侧芽萌发与对照相比无明显差异。