论文部分内容阅读
鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium,STM）是沙门菌一个重要的血清型,是一种主要引起人畜胃肠炎的病原菌。OppA与沙门菌氨基酸和肽的摄取有着重要的关系,属ABC转运蛋白。oppA mRNA是已验证受Hfq伴侣蛋白依赖型小RNA GcvB转录后调控的靶标,STM中主要以Hfq-GcvB-oppA mRNA三元复合体形式存在。先前的研究表明STM Hfq通过募集GcvB与oppA mRNA,保护GcvB避免被核酸酶降解的同时增强了GcvB与oppA mRNA结合的效率。另外,GcvB主要以其R1功能基序与oppA mRNA 5’UTR富含GU的序列结合也已被阐明。但Hfq是否可独立于GcvB直接转录后调控oppA mRNA,Hfq维持GcvB稳定性的分子机制如何,目前尚无相关研究报道。本研究以STM为研究对象,筛查Hfq与GcvB和oppA mRNA潜在的作用位点,并对其进行截短、突变或缺失。通过分析基因转录和蛋白水平的变化,初步验证Hfq与GcvB和oppA mRNA潜在的作用位点。为阐明Hfq、GcvB和靶基因三者的作用分子机制奠定基础,为新型抗菌药物的研制和新型原核细胞基因编辑技术的开发提供理论前提。研究内容包括:1、STM Hfq与sRNA GcvB对靶基因oppA的调控作用为证明Hfq是否可独立于GcvB调控oppA mRNA,本研究运用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统,构建STM oppA::lacZ基因融合菌株,并通过P22噬菌体转导技术构建相应的gcvB和hfq基因缺失菌株,qRT-PCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测重组菌株oppA基因转录和蛋白水平。结果显示,与对照组相比,敲除gcvB基因使oppA基因转录和蛋白水平分别上调4.4和5.4倍;敲除hfq基因使oppA基因转录和蛋白水平分别上调6.5和6倍;同时敲除gcvB和hfq基因,oppA基因转录和蛋白水平分别上调6.8和8.3倍。结果表明,Hfq存在独立于GcvB对oppA mRNA冗余的负调控作用。该结果为进一步研究Hfq与oppA mRNA的作用机制提供了理论依据。2、STM Hfq与oppA mRNA 5′UTR结合位点的预测与验证分析为探究Hfq与oppA mRNA 5′UTR可能的作用结合位点,本研究通过5′RACE技术分析oppA mRNA的5′UTR,并筛查oppA mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序（ARN）n。利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建oppA基因（ARN）n基序缺失及点突变基础上的lacZ基因融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的gcvB和hfq基因缺失菌株。通过qRT-PCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测重组菌株oppA基因转录和蛋白水平。5′RACE结果显示,oppA mRNA 5′UTR长度为159 bp。在oppA mRNA 5′UTR中预测到2个Hfq结合偏好型基序ARN-1和ARN-2。qRT-PCR和β-半乳糖苷酶试验实验结果显示,分别或同时敲除ARN-1和ARN-2基序与分别或同时点突变ARN-1和ARN-2基序呈现相似的结果,与对照组相比,oppA基因转录和蛋白水平总体呈下调趋势,ARN-1和ARN-2基序单独或同时点突变对oppA基因的表达具有程度不同的抑制作用,hfq基因缺失时抑制最为明显。以上结果表明,经预测的ARN-1和ARN-2基序与Hfq正调控oppA mRNA的机制相关,并推测Hfq通过与ARN-1和ARN-2基序结合从而发挥作用。3、STM Hfq与sRNA GcvB结合位点的预测与验证分析为探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点,本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株,构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因蛋白水平。预测结果显示,GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U5和U8。qRT-PCR结果显示,U5基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化,而gcvB基因转录水平随U8基序的截短而下调,截短为U5和U4时下调最为明显,分别下调1.7和1.5倍。延伸U4截短菌株的GcvB终止子茎,结果发现,gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平,同时也发现,尽管U4截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复,却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明,U5基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U8基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性来说是重要的,推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。4、STM Hfq关键作用位点的分析为探究Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株以及HfqC端截短菌株,在此基础上,构建相应的Hfq-His6蛋白标签融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的gcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过Western Blot试验检测hfq基因的蛋白水平,qRT-PCR检测gcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因蛋白水平。Western Blot试验结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变以及HfqC端的截短均不同程度的上调了hfq基因的蛋白水平。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使gcvB基因转录水平下调2.6倍。qRT-PCR与β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变以及HfqC端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度的上调了oppA基因蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变以及HfqC端分别截断至第65位和72位氨基酸时,oppA基因蛋白水平上调最为明显,分别上调2.9、3.3和2倍。以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性来说是重要的。Hfq近端面56位氨基酸以及HfqC端65至87位氨基酸与oppA基因蛋白水平呈负相关。