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猪源产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是指主要引起新生幼畜腹泻最常见的病原性大肠杆菌,其引起宿主致病的主要毒力因子包括黏附素,肠毒素,溶血素,鞭毛等。由其引起的断奶仔猪腹泻(Porcine post-weaning diarrhea,PWD)是导致仔猪发病死亡的重要原因,也是造成全球养猪业经济损失的重要因素之一。细菌非编码sRNA是一类新型的基因调控子,主要在转录后水平调控基因的表达。鉴于sRNA伴侣蛋白Hfq在调控多种细菌表型、生长代谢、生物被膜形成及致病性等方面均发挥十分重要的作用,但其在猪源ETEC中的靶标基因及调控作用还不清楚,本研究针对ETEC C83902中伴侣蛋白Hfq的毒力相关调控作用进行了如下研究。1.K88ac+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关调控功能研究本研究通过λ-Red同源重组技术构建hfq基因缺失株C83902△hfq,并通过基因克隆技术构建其回补株C83902△hfq/phfq。在转录水平上,以大肠杆菌gapA基因为内参,通过qRT-PCR检测fimA基因(编码Ⅰ型菌毛主要结构亚基)、fliC基因(编码鞭毛主要亚单位)、faeG基因(编码K88菌毛主要结构亚基)、eltB基因(编码LT毒素B亚单位)、ecpA基因(编码共生菌毛主要亚单位)、luxS基因和pfs基因(编码群体感应相关因子)的表达。结果发现,相比野生株C83902, hfq基因缺失株C83902△hfq中fimA、faeG、ecpA基因表达量均显著下调,分别下调了63.1%(P<0.01)、38.8%(P<0.01)、39.4%(P<0.01); fliC、 eltB、luxS、pfs基因表达量均少许上调,但差异不显著(P>0.05)。在蛋白表达水平上,以GapA蛋白为内参,通过Western blot检测三种菌株中FimA、FaeG、EcpA、FliC四种蛋白表达量的变化,三次平行试验后,对Western blot试验结果进行灰度值量化分析,结果显示,hfq基因缺失株中FimA、FaeG、EcpA三种蛋白表达量明显下调,相比野生株,分别下调了29% (P<0.05)、23.8% (P<0.05)、20% (P<0.05),但FliC蛋白表达量变化不明显,此结果与qRT-PCR试验结果相一致。综合上述结果,我们推测伴侣蛋白Hfq能调控ETECC83902中ecpA、faeG、fimA菌毛基因及相关蛋白的表达,但是否影响其致病性有待后续验证。2.K88ac+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq对其致病性调控作用研究在上述研究一结果的基础上,通过生长试验、生物被膜定性及定量试验、IPEC-J2细胞黏附试验和小鼠攻毒试验,探究伴侣蛋白Hfq对ETEC致病性的影响。结果表明,缺失株C83902△hfq在对数生长期生长速率明显低于野生株(P<0.05)；生物被膜的形成能力及对IPEC-J2细胞黏附能力均显著下调,相比野生株分别下调了80% (P<0.01)和78%(P<0.01),而回补株的生长、生物被膜形成及细胞黏附性均有部分恢复。随后,以SPF级BALB/c小鼠为模型设计小鼠攻毒试验,采用直接灌胃方法分别对各攻毒组小鼠接种109cfu剂量的三株菌悬液,定期观察接种后小鼠状态(饮水、饮食、精神状况和死亡情况),72h后,采集肠液稀释涂板计数。结果发现,野生株C83902组及回补株组小鼠均出现采食量减少,行动迟缓,解剖时肠道有轻微鼓气和充血,缺失株C83902△hfq组和PBS组小鼠则无上述症状；平板计数结果发现,与野生株相比较,hfq基因缺失株在小鼠肠道的定植能力显著下降,于十二指肠、空肠和回肠分别下降99% (P<0.01),98% (P<0.01)和89%(P<0.01),从而初步在动物体内验证了伴侣蛋白Hfq能够调控部分菌毛黏附素的表达而影响C83902在肠道上皮的定植及致病作用。综上所述,伴侣蛋白Hfq能通过调控ETECC83902中ecpA、faeG、fimA菌毛基因及相关蛋白的表达进而调控其致病性作用。