华癸根瘤菌7653R RNA伴侣蛋白Hfq共生固氮功能和生物学特性研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mixiaoya2008
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Hfq(Host factor)是原核生物中广泛存在且高度保守的RNA伴侣蛋白,结构与真核生物Sm蛋白类似,通过参与ncRNAs(non-coding RNAs)与其靶标mRNAs的互作过程,在转录水平上进行调控。本文围绕华癸中慢生根瘤菌7653Rhfq基因的共生固氮功能及生物学特性展开研究,并在7653R中初步探索构建基因快速敲除的技术方法平台。  本研究通过构建单交换突变载体、两亲本接合转移和选择培养基筛选,获得了hfq插入失活突变株7653RΔhfq。对突变株的培养特征和共生表型进行了检测,结果显示在自生条件下突变株7653RΔhfq的生长速率比野生型减慢;共生条件下与突变株7653RΔhfq共生的紫云英表现出明显的缺氮特征,所形成的根瘤为白色小瘤,根瘤固氮酶活明显下降;采用荧光定量PCR检测了hfq基因的表达水平和特性,发现其在根瘤形成的各个阶段表达量基本持平,但自生状态下的表达量比共生条件高。基于高通量sRNA测序结果与分析,选择可能与Hfq互作的4个候选sRNA,比较检测了这4个sRNA在hfq突变株中的表达量变化。结果显示,Hfq很可能通过与这些sRNA互作影响共生固氮功能。对培养条件下的7653R和突变株7653RΔhfq进行了抗胁迫能力的比较,结果表明在应对热激处理、4.5%乙醇以及50mmol H2O2胁迫中,hfq都发挥了重要作用。  本研究还在7653R菌株中进行了基因快速敲除方法的探索,旨在将Red重组系统应用到根瘤菌中构建目标基因突变体。Red重组系统以其同源臂短,操作简便,重组率高的特点在大肠杆菌中得到了广泛运用,能够实现基因连续的缺失突变。本研究对Red重组系统进行了改造和初步的探索实验,为以后该技术方法的建立和应用提供了工作基础。
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