沙门菌是兼性胞内寄生的人兽共患病原菌,可广泛感染很多动物,还能够通过肉类、鸡蛋、牛奶甚至果蔬等食品传染给人,引起肠胃炎等疾病甚至死亡,公共卫生意义重大。高效、快速的检测方法是有效开展沙门菌防控的重要前提。沙门菌的传统检测方法是微生物培养法,步骤较为复杂,需要1周左右才能完成检测,难以满足快速检测沙门菌的需求。基于分子生物学的PCR检测方法具有操作简单、试验周期短等优点,是沙门菌快速检测方法研究的重要内容。沙门菌外膜蛋白一般位于菌体表面,在诊断技术开发和疫苗研制方面有着重要潜能。PagN蛋白是一种8次跨膜的沙门菌外膜蛋白,具有4个胞外区,在不同沙门菌血清型中广泛分布且高度保守,而在大肠杆菌等非沙门菌中不存在,有望作为沙门菌属特异性检测的新靶标。单克隆抗体（Monoclonal Antibody,mAb）能够特异性识别相应抗原,用于病原微生物的检测具有高灵敏度和特异性少或无交叉反应等优点,在沙门菌防控中同样具有重要作用。基于单克隆抗体制备的免疫磁珠能够在磁场作用下对样品实现快速富集、分离,在样品预处理阶段发挥了重要作用。通过研制PagN蛋白的单克隆抗体并制备免疫磁珠,有望实现对样品中沙门菌的特异性富集和分离,从而节省样品预处理时间,与后续PCR检测方法等技术结合达到快速检测沙门菌的目的。本研究以沙门菌外膜蛋白pagN基因为检测靶标,建立了 PCR检测方法,评价其特异性、敏感性,并应用于猪肉样品及鸡胚样品中沙门菌的检测;同时,通过大肠杆菌原核表达系统表达并纯化了沙门菌重组PagN蛋白（rPagN）,免疫BALB/c小鼠,利用B细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,与纳米磁珠偶联制备免疫磁珠用于沙门菌的特异性富集,结合建立的pagN PCR检测方法,实现对猪肉样品沙门菌的快速检测,为沙门菌的有效防控提供了新的技术手段。1沙门菌pagN快速PCR检测方法的建立及应用以肠炎沙门菌C50041的pagN基因为靶标,建立沙门菌属特异性的PCR检测方法。利用NCBI数据库中细菌基因组序列比对分析了 10318株沙门菌和部分非沙门菌菌株中pagN的分布和相似性情况,结果显示99.73%的沙门菌中都存在pagN和stn基因,且相似性达86.2%以上,而非沙门菌中不存在pagN基因。建立并优化了基于沙门菌pagN基因的PCR扩增体系和扩增条件,18株A-F血清群常见沙门菌菌株为模板均能扩增出556 bp大小的特异性目的条带,14株非沙门菌菌株为模板均无任何条带出现,表明PCR的特异性良好;敏感性分析结果表明,pagN PCR的检测限可达到10 CFU/mL的沙门菌或32.2 ng/mL的沙门菌基因组DNA。将该PCR方法用于猪肉模拟污染样品中沙门菌的检测,增菌培养6h后可检测出104 CFU/10 g的沙门菌污染,继续增菌培养4 h后即可检测出1 CFU/10 g的沙门菌污染。进一步将该方法用于采集的猪肉样品和鸡胚样品中沙门菌的检测,40份猪肉样品和21份鸡胚样品经BPW预增菌后,取增菌液同步进行pagN的PCR检测和传统微生物培养法检测,结果显示pagN PCR检测出8份阳性样品,其中5份阳性样品与传统微生物培养法检测结果一致,但前者耗时仅需26 h,检测效率相比传统微生物培养法提高了 3.77倍。本研究建立的PCR检测方法具有高灵敏度、特异性强等优点,可作为一种沙门菌快速检测的新方法。2沙门菌PagN蛋白单克隆抗体的制备及鉴定以肠炎沙门菌C50041基因组为模板扩增pagN基因,分别与pCold I和pGEX-6P-1连接构建重组质粒,经PCR和测序验证正确后转入BL21（DE3）中诱导表达和纯化重组PagN蛋白。SDS-PAGE结果显示,His-PagN重组蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后通过变复性的方式获得纯度较高的大小为27 kDa重组蛋白;GST-PagN主要以可溶性形式表达,直接纯化后获得纯度较高的大小为46kDa重组蛋白,分子量与理论大小一致。Western Blot分析显示两种重组蛋白均在预期大小位置显示出单一条带,表明其具有良好的免疫反应性。以His-PagN免疫BALB/c小鼠,制备B细胞杂交瘤。以GST-PagN为检测抗原,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3次亚克隆后获得8株稳定分泌PagN蛋白单抗的杂交瘤细胞,其中1D9、3B3、3F10、4C4、5B1单抗的腹水效价均在2.0×1 05以上。5株单抗的Western Blot分析显示其与His-PagN重组蛋白均具有良好的反应性。通过SDS-PAGE、Western Blot及ELISA等方法以及pagN基因缺失沙门菌等进一步对1D9单抗的亲和力、特异性、单抗纯度及反应谱等特性进行分析。1D9单抗的亲和为4.62×108 M-1,与PagN以外的其他沙门菌蛋白无交叉反应,与不同血清型沙门菌反应且条带单一,而与非沙门菌不反应,表明该单抗可特异性识别沙门菌属菌株,在沙门菌检测方面具有良好的应用潜能。3沙门菌PagN单抗免疫富集磁珠的制备及应用将1D9单抗与纳米磁珠微球进行偶联制备免疫磁珠,用于沙门菌的富集,与pagN PCR检测方法相结合,实现对样品中沙门菌的快速检测。本研究对磁珠偶联抗体的时间、磁珠的使用量、磁珠抗体复合物捕获沙门菌的时间进行了优化,确定了沙门菌PagN单抗免疫磁珠制备和富集沙门菌的条件为2.5 mg羧基磁珠与1D9单抗偶联1 h,与待测样品孵育1.5 h。使用制备的免疫磁珠对102 CFU、103 CFU、104 CFU沙门菌进行捕获时,其富集效率均在80%以上,其中对103 CFU沙门菌捕获效率最高,为88.66%。使用制备的免疫磁珠对不同血清型沙门菌和非沙门菌进行捕获时,其对沙门菌的富集效率均在75%以上,其中对肠炎沙门菌的富集效率最高,为86.99%;而对非沙门菌菌株的非特异性捕获效率均小于6%。最后,将免疫磁珠富集方法与pagNPCR方法相结合构建了沙门菌IMBs-PCR检测方法,用于市场采集猪肉样品中的沙门菌检测。农贸市场随机采集的30份猪肉样品经PBS洗涤,取洗涤液液同步进行沙门菌的IMBs-PCR法、传统微生物培养法和pagNPCR检测,结果显示IMBs-PCR法、传统微生物培养法均检测出同6份阳性样品,pagN PCR未检测出阳性样品。说明本研究建立的IMBs-PCR方法与传统微生物培养法的符合率为100%,但是前者检测耗时仅为后者的3.6%,通过免疫磁珠的富集处理可有效提高pagN PCR的检测敏感性,极大提高了沙门菌的检测效率。