【摘 要】
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目的:通过体外培养大鼠视网膜Müller细胞（Retina Müllercells,RMCs）,观察依洛尤单抗（Evolocumab）对模拟糖尿病（diabetesmellitus,DM）环境下大鼠RMCs的保护作用机制及对炎症因子表达的影响。方法:采用胰酶消化法来培养大鼠RMCs,通过细胞形态观察和细胞免疫荧光染色对RMCs进行细胞鉴定。通过CCK-8检测浓度分别为0、100、200、400、8
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目的:通过体外培养大鼠视网膜Müller细胞（Retina Müllercells,RMCs）,观察依洛尤单抗（Evolocumab）对模拟糖尿病（diabetesmellitus,DM）环境下大鼠RMCs的保护作用机制及对炎症因子表达的影响。方法:采用胰酶消化法来培养大鼠RMCs,通过细胞形态观察和细胞免疫荧光染色对RMCs进行细胞鉴定。通过CCK-8检测浓度分别为0、100、200、400、800μmol/L的氯化钴（CoCl2）作用24h及浓度分别为0、1、10、50、100、150、200μg/ml的Evolocumab作用24、48、72h后对RMCs细胞活性的影响,确定CoCl2及Evolocumab的作用浓度。将RMCs分为高糖缺氧组、Evolocumab处理组和空白对照组,划痕试验检测不同组作用72h后对RMCs迁移水平的影响,Western blot分别检测不同组在作用 24、48、72h 后,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）,前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（protease proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）,巨噬细胞趋化蛋白-1（macrophage chemotactic protein-1,MCP-1）,白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）,白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α,TNF-α）,Toll 样受体-4（Toll-likereceptor-4,TLR-4）,核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB,NF-κB）,磷酸化核转录因子-κB（phosphorylated nuclear transcription factor-κB,p-NF-κB）蛋白的表达。结果:经细胞形态和免疫荧光鉴定,本次实验成功培养出RMCs。CCK-8结果确定最终以25mmol/L葡萄糖和200μmol/L CoCl2作用于RMCs建立高糖低氧诱导的体外糖尿病细胞模型以及确定Evolocumab的最佳药物作用浓度为100μg/ml。划痕试验结果显示高糖缺氧组较空白组细胞迁移快（P＜0.05）,而Evolocumab可以在一定程度上抑制细胞迁移（P＜0.05）。WB结果显示与空白组相比,高糖缺氧组RMCs内GFAP、PCSK9、IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1、TLR-4和 p-NF-κB 表达均升高（P＜0.05）;与高糖缺氧组比较,Evolocumab组均降低（P＜0.05）,NF-κB在三组间表达无明显差异（P＞0.05）。结论:RMCs在高糖低氧诱导的体外糖尿病细胞模型下高表达GFAP和PCSK9;而在Evolocumab的干预下,PCSK9蛋白表达变化与RMCs胶质增生存在一定的相关性,TLR-4/NF-κB信号通路可能参与其中,降低了 RMCs产生的IL-1,IL-6,TNF-α和MCP-1的表达水平,减轻炎症反应。
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