姜黄素与miR-100-5p对砷致HaCaT恶性表型细胞的作用及其机制研究

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研究目的:本研究拟通过制备砷致HaCaT恶性表型细胞(AS-TM细胞),用不同浓度的姜黄素对AS-TM细胞进行处理,研究姜黄素作用前后AS-TM细胞内血管内皮生长因子(VEGF)表达强度,以探究姜黄素抑制AS-TM细胞增殖机制。方法:1.将HaCaT细胞培养于含砷浓度为100n M的完全培养基中,180天后收集制备AS-TM细胞。2.将AS-TM细胞分为2组,分别给予0 ug/ml、20ug/ml姜黄素对细胞进行处理,24小时后运用RT-PCR检测姜黄素作用前后AS-TM细胞内血管内皮生长因子VEGFm RNA表达强度。结果:1.RT-PCR检测到VEGFm RNA在姜黄素组的表达明显低于对照组,其表达量约为对照组的0.44倍。结论:1.本实验成功建立了砷致HaCaT恶性表型细胞(称为AS-TM细胞)模型。2.姜黄素有可能通过下调VEGF的表达,抑制AS-TM细胞的血管生成,进而抑制了AS-TM细胞的增殖。目的:本实验拟通过Lipofectamine 2000转染miR-100-5p抑制物及其模拟物,研究miR-100-5p对砷致HaCaT恶性表型细胞增殖、凋亡的影响及其与自噬相关影响因子之间的关系。方法:1.采用RT-PCR法检测miR-100-5p在HaCaT细胞与砷致HaCaT恶性表型细胞(即AS-TM细胞)中的表达差异。2.将AS-TM细胞随机分为五组,分别是:miR-100-5p mimics组、mimics NC组、miR-100-5p inhibitors组、inhibitors NC组及空白组,通过Lipofectamine 2000分别将miR-100-5p抑制物、模拟物及其各自的阴性对照转染至AS-TM细胞中,空白组不做转染。3.通过RT-PCR法检测转染48小时后五组细胞内miR-100-5p的表达情况。4.采用CCK8法检测转染48小时后各组AS-TM细胞的增殖能力。5.采用流式细胞术检测转染48小时后五组AS-TM细胞的凋亡情况。6.RT-PCR法检测转染72小时后各组细胞中自噬相关基因m TOR、Beclin1、LC3B的m RNA表达情况。结果:1.通过RT-PCR检测,miR-100-5p在砷致HaCaT恶性表型细胞中的表达高于HaCaT细胞,其表达量约为HaCaT细胞的1.4倍。2.Mi R-100-5p mimics组中miR-100-5p的表达量明显高于空白组及其对照组(mimics NC组);miR-100-5p inhibitors组中miR-100-5p的表达量低于空白组及其对照组(inhibitors NC组);mimics NC组、inhibitors NC组与空白组相比,无明显差异。3.通过CCK8法检测,结果显示,miR-100-5p mimics组中AS-TM细胞的增殖能力与空白组及其对照组(mimics NC组)相比无明显改变;miR-100-5p inhibitors组中AS-TM细胞的增殖能力低于空白组及其对照组(inhibitors NC组)。mimics NC组、inhibitors NC组和空白组相比,AS-TM细胞增殖能力无明显差异。4.流式细胞仪检测细胞凋亡率,转染48小时后,各组的凋亡率分别是:control组(4.89%+8.76%)、miR-100-5p inhibitors(7.7%+17.13%)、inhibitors NC组(4.12%+12.12%)、miR-100-5p mimics组(5.05%+13.13%)、mimics NC组(4.26%+16.91%),表明下调miR-100-5p的表达可以促进AS-TM细胞的凋亡。5.RT-PCR法检测转染72小时后各组细胞中自噬基因m TOR、Beclin1、LC3B的m RNA表达量,实验结果显示,miR-100-5p mimics组的m TOR m RNA的表达量较mimics NC组及空白对照组降低,差异具有统计学意义;inhibitors组与inhibitors NC组和空白对照组相比,无明显差异;mimics NC组、inhibitors NC组和空白对照组相比,无明显差异。Mi R-100-5p mimics组、inhibitors组中LC3B、Beclin1 m RNA的表达量与各自阴性对照组及空白对照组、阴性对照组与空白对照组相比无统计学意义。结论:1.Mi R-100-5p在砷致HaCaT恶性表型细胞中的表达高于HaCaT细胞。2.下调miR-100-5p可显著抑制AS-TM细胞的增殖能力,促进其凋亡;上调miR-100-5p,对AS-TM细胞的增殖及凋亡无明显影响。Mi R-100-5p在砷致HaCaT恶性转化中可能发挥着类似促癌基因的作用。3.上调或下调miR-100-5p,在基因水平上,对AS-TM细胞自噬相关基因Beclin1、LC3B无明显影响;上调miR-100-5p,对m TOR m RNA的表达具有抑制作用,miR-100-5p有可能通过m TOR进而影响AS-TM细胞的自噬,值得进一步研究。4.Mi R-100-5p有可能成为砷致皮肤癌诊断和治疗的新靶点。
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