【摘 要】
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第一部分以P-糖蛋白和能量代谢为作用靶点:二甲双胍联用2-脱氧果糖逆转K562/Dox细胞对多柔比星耐药性的研究目的:本实验旨在探究二甲双胍联用2-脱氧果糖能否在体外逆转多柔比星耐药的K562/Dox细胞的多药耐药现象并探讨两药联用在逆转耐药中可能的机制。方法:使用MTT实验检测细胞活性。通过双向转运实验确定二甲双胍外排与P-糖蛋白（P-gp）的关系。在mRNA、蛋白表达及转运功能三方面考察P-g
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第一部分以P-糖蛋白和能量代谢为作用靶点:二甲双胍联用2-脱氧果糖逆转K562/Dox细胞对多柔比星耐药性的研究目的:本实验旨在探究二甲双胍联用2-脱氧果糖能否在体外逆转多柔比星耐药的K562/Dox细胞的多药耐药现象并探讨两药联用在逆转耐药中可能的机制。方法:使用MTT实验检测细胞活性。通过双向转运实验确定二甲双胍外排与P-糖蛋白（P-gp）的关系。在mRNA、蛋白表达及转运功能三方面考察P-gp的变化。应用Western blot对ERK1/2和磷酸化ERK1/2进行定量。通过检测葡萄糖摄取、乳酸产生量、ATP含量和自噬水平来了解代谢水平变化。通过流式细胞术和caspase-3活性来确定细胞凋亡情况。结果:二甲双胍联用2-脱氧果糖选择性地增加K562/Dox细胞对多柔比星的敏感性。二甲双胍并不是P-gp的底物但却通过抑制ERK通路下调K562/Dox细胞中P-gp的表达使P-gp的外排功能减弱。二甲双胍联用2-脱氧果糖对K562和K562/Dox细胞的能量代谢造成压力,两药联用明显抑制细胞的葡萄糖摄取及乳酸生成,导致ATP生成明显减少,同时细胞自噬增加。代谢压力同时造成细胞凋亡增加。P-gp底物选择性地在K562/Dox细胞中增加两药联用引起的ATP消耗与细胞凋亡。结论:1.二甲双胍通过抑制ERK通路下调P-gp。2.P-gp底物选择性地在耐药细胞中增加由二甲双胍联用2-脱氧果糖引起的ATP消耗并明显促进耐药细胞的凋亡。第二部分以p53、P-糖蛋白和能量代谢为作用靶点:二甲双胍联用2-脱氧果糖逆转MCF-7/Dox细胞对多柔比星耐药性的研究目的:本实验旨在探究二甲双胍与2-脱氧果糖联合应用能否在体外逆转多柔比星耐药的乳腺癌细胞（MCF-7/Dox）的多药耐药并探讨两药联用在逆转耐药中的机制。方法:使用MTT实验检测细胞活性。葡萄糖摄取、乳酸产生量、脂肪酸产量和ATP含量变化来了解细胞能量代谢水平变化情况。细胞周期检测和caspase-3活性分别用来确定药物对细胞周期和凋亡活性的影响。P-糖蛋白（P-gp）表达和功能的变化通过实时定量PCR检测P-gp mRNA表达、P-gp ATP酶活性及多柔比星蓄积来确定。对p53通路相关蛋白和AKT/mTOR相关蛋白则通过Western blot检测。结果:二甲双胍与2-脱氧果糖联用在MCF-7/Dox细胞中表现出更强的增殖抑制作用并可以选择性地增加多柔比星对MCF-7/Dox的细胞毒性。两药联用使MCF-7和MCF-7/Dox细胞周期阻滞在G2-M期同时明显升高凋亡活性。两药联用还可以分别抑制MCF-7/Dox细胞中MDM2与MDMX增加p53的表达从而抑制Cyclin B1、Cyclin D1、Bcl-2并增加BAX、caspase9的表达。两药联用并不影响P-gp的mRNA表达和P-gp ATP酶活性,但可以少量增加多柔比星在MCF-7/Dox细胞中的蓄积,该作用可能是抑制能量代谢的结果。两药联用明显抑制细胞的葡萄糖摄取、乳酸和脂肪酸生成,导致ATP生成明显减少。两药联用明显抑制mTOR的表达及其磷酸化并增加AKT的磷酸化,同时显著抑制脂肪酸合成酶和乙酰辅酶A羧化酶的表达。此外,多柔比星可以选择性地在MCF-7/Dox细胞中增强二甲双胍与2-脱氧果糖造成的代谢压力并增强凋亡活性结论:1.二甲双胍与2-脱氧果糖联用,可通过抑制MDM2与MDMX表达并增加p53的表达后,恢复p53的作用,从而来增强多柔比星敏感性;2.二甲双胍与2-脱氧果糖联用对MCF-7和MCF-7/Dox细胞造成极大的代谢压力,多柔比星可以选择性地在MCF-7/Dox细胞中增强二甲双胍与2-脱氧果糖造成的代谢压力,并增强MCF-7/Dox细胞的凋亡活性。
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