马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus, SEZ)能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎及突发性死亡,是猪链球菌病的重要病原。类M蛋白(M-like protein gene, SzP)是该菌一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,能够抵抗吞噬细胞对其的吞噬作用,是良好的保护性抗原；纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin-binding protein, FNZ)和IgG结合蛋白(IgG-binding protein,ZAG)在介导感染、抗调理吞噬以及模拟宿主自身成份逃避免疫的过程中起重大作用。本实验旨在研制SzP、FNZ和ZAG融合亚单位疫苗,为猪链球菌病的防治提供新手段。1马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株SzP、FNZ、ZAG部分片段的原核表达及免疫保护试验根据马链球菌兽疫亚种(SEZ)SzP、FNZ和ZAG已发表的基因序列,通过DNAStar软件分析,选取抗原性较好的片段,各设计合成一对引物,以马链球菌兽疫亚种ATCC35246的基因组为模板,扩增SzP (527-1044bp GenBank登录号：AY263781)FNZ (1012-1519bp GenBank登录号：DQ363208). ZAG (134-664bp GenBank登录号：U25852)。分别将扩增的目的片段以正确的阅读架定向克隆于pET32a中,分别构建原核表达载体pET32a-szp、pET32a-fnz、pET32a-zag,然后将重组质粒转化表达宿主菌BL21中,在37℃1.OmM/L IPTG诱导下该片段获得良好表达,进一步通过SDS-PAGE分析表明融合蛋白位于菌体超声裂解后的上清中。Western blot分析显示,表达的蛋白能与ATCC35246全菌制备的抗血清发生特异性反应,动物实验表明SzP、FNZ和ZAG三种表达蛋白对小鼠的免疫保护率分别达到70%、60%、60%。2马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株SzP、FNZ、ZAG基因融合载体的构建以常规分子克隆的方法将上述扩增的SzP基因片段克隆至pET-32a,用重叠PCR将上述FNZ、ZAG基因片段串联,与pET32a-szp连接,构建pET32a-szp-fnz-zag重组表达载体,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为75kD的融合蛋白。Western blot分析显示,表达的蛋白能与ATCC35246全菌制备的抗血清发生特异性反应,表明其具有良好的免疫反应性。3动物保护试验以His亲和层析柱纯化表达蛋白,将纯化好的蛋白与ISA206佐剂1：1进行乳化后免疫ICR小鼠。同时设立全菌和空白对照组。二免后以0.2mL (1.0×l07cell/mL) ATCC35246强毒株攻击后,免疫组小鼠的保护率达到80%,通过半定量RT-PCR检测显示,免疫鼠IL-4、IFN-y基因的转录水平比对照组提高了50%以上。