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目的:子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系统三大常见恶性肿瘤之一。近年来,子宫内膜癌的发病率不断上升,且呈现发病年龄逐渐年轻化的趋势。Ⅰ型子宫内膜癌约占子宫内膜癌的80%左右,但其确切病因和发病机制仍不十分清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是近年来继miRNA后,又一被广泛关注的分子标志物。LncRNA可在细胞内从表观遗传学、转录水平及转录后水平等多种层面调控基因表达,参与多种重要调控过程,与肿瘤的发生和发展密切相关。本课题组前期利用Arraystar人类lncRNA V3.0芯片对Ⅰ型子宫内膜癌组织进行lncRNA表达谱筛查及组织验证,发现HOXA反义转录物髓系异构体1(HOXA transcript antisense RNA,myeloid-specific 1,HOTAIRM1)是其中明显上调的lncRNA之一。研究发现,反义lncRNA可调控其正义链基因的表达从而发挥生物学作用。HOTAIRM1是同源异型盒(homeobox genes,HOX)基因簇中HOXA1基因的反义转录物。HOXA1被报道在多种肿瘤高表达,是肿瘤发生、发展过程中的关键因子。因此,结合本课题组前期芯片结果及国际研究进展,本研究旨在探讨lncRNA HOTAIRM1及HOXA1基因在Ⅰ型子宫内膜癌发生发展中的作用,为Ⅰ型子宫内膜癌的诊断和治疗提供新靶点。研究方法:1、研究lncRNA HOTAIRM1及HOXA1基因在Ⅰ型子宫内膜癌组织中的表达及意义。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HOTAIRM1及HOXA1 mRNA在Ⅰ型子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织的表达;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测HOXA1蛋白在Ⅰ型子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织的表达;分析HOTAIRM1与HOXA1表达的相关性;分析HOTAIRM1及HOXA1的表达与Ⅰ型子宫内膜癌患者临床病理特征的关系。2、研究lncRNA HOTAIRM1与HOXA1基因的调控关系及两者对Ⅰ型子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及可能机制。体外细胞实验,构建HOTAIRM1基因敲减及过表达稳转细胞系及HOXA1基因敲减稳转细胞系,qRT-PCR及Western blotting验证转染效率。研究HOTAIRM1将细胞分为五组:(1)空白对照组(Control),(2)过表达对照组(GV367-NC),(3)过表达组(GV367-HOTAIRM1),(4)敲减对照组(shRNA-NC),(5)敲减组(sh-HOTAIRM1)。研究HOXA1将细胞分为三组:(1)空白对照组(Control),(2)敲减对照组(shRNA-NC),(3)敲减组(sh-HOXA1)。Western blotting检测各组细胞中HOXA1蛋白的表达变化;CCK-8细胞增殖实验检测各组细胞增殖活性;Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布变化。体内动物实验,利用裸鼠体内成瘤实验,研究敲减及过表达HOTAIRM1、敲减HOXA1对Ⅰ型子宫内膜癌细胞皮下成瘤及生长能力的影响。Western blotting检测各组细胞中Cyclin D1和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达变化及NF-κB信号通路相关蛋白p-p65和p65的表达变化。结果:1、qRT-PCR结果显示HOTAIRM1及HOXA1 mRNA在Ⅰ型子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜(P<0.01)。Western blotting结果显示HOXA1蛋白在Ⅰ型子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜(P<0.01)。HOTAIRM1与HOXA1表达水平呈显著正相关(P<0.01)。HOTAIRM1及HOXA1的表达与Ⅰ型子宫内膜癌患者FIGO分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05),而与患者年龄、细胞分化程度及肌层浸润深度无明显相关性(P>0.05)。2、(1)qRT-PCR结果显示,与GV367-NC组和Control组比,感染HOTAIRM1过表达慢病毒GV367-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞中HOTAIRM1表达水平明显升高(P<0.05);与shRNA-NC组和Control组比,转染sh-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞中HOTAIRM1表达水平明显降低(P<0.05),提示细胞转染成功。CCK-8结果显示,与GV367-NC组和Control组比,GV367-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞增殖能力明显增高(P<0.05);与shRNA-NC组和Control组比,sh-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞增殖能力明显减低(P<0.05)。流式细胞仪结果显示,GV367-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞G0/G1期比例明显减少,S期比例明显增加(P<0.05);sh-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞G0/G1期比例明显增加,S期比例明显减少(P<0.05)。Transwell实验结果显示,GV367-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞迁移及侵袭能力明显增高(P<0.05);sh-HOTAIRM1组Ishikawa和HEC-1A细胞迁移及侵袭能力明显减低(P<0.05)。Western blotting结果显示,GV367-HOTAIRM1组N-cadherin、Cyclin D1及p-p65表达水平升高,E-cadherin表达水平降低(P<0.05),各组间p65表达水平无明显差异(P>0.05);sh-HOTAIRM1组N-cadherin、Cyclin D1及p-p65表达水平降低,E-cadherin表达水平升高(P<0.05),各组间p65表达水平无明显差异(P>0.05)。裸鼠体内成瘤实验结果显示,与GV367-NC组和Control组比,GV367-HOTAIRM1组裸鼠皮下成瘤早,肿瘤生长速度快,同期肿瘤体积明显增大(P<0.05);与shRNA-NC组和Control组比,转染sh-HOTAIRM1组裸鼠皮下成瘤明显延迟,肿瘤生长速度慢,同期肿瘤体积明显减小(P<0.05)。(2)qRT-PCR及Western blotting结果显示,敲减HOTAIRM1后Ishikawa和HEC-1A细胞中HOXA1 mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),过表达HOTAIRM1后,HOXA1 mRNA及蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)。(3)qRT-PCR及Western blotting结果显示,与shRNA-NC组和Control组比,转染sh-HOXA1组Ishikawa和HEC-1A细胞中HOXA1mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),提示细胞转染成功。CCK8结果显示,与shRNA-NC组和Control组比,sh-HOXA1组Ishikawa和HEC-1A细胞增殖能力明显减低(P<0.05)。流式细胞仪结果显示,sh-HOXA1组Ishikawa和HEC-1A细胞G0/G1期比例明显增加,S期比例明显减少(P<0.05)。Transwell实验结果显示,sh-HOXA1组Ishikawa和HEC-1A细胞迁移及侵袭能力明显减低(P<0.05)。Western blotting结果显示,sh-HOXA1组N-cadherin、Cyclin D1及p-p65表达水平降低,E-cadherin表达水平升高(P<0.05),各组间p65表达水平无明显差异(P>0.05)。裸鼠体内成瘤实验结果显示,与shRNA-NC组和Control组比,转染sh-HOXA1组裸鼠皮下成瘤明显延迟,肿瘤生长速度慢,同期肿瘤体积明显减小(P<0.05)。结论:1、LncRNA HOTAIRM1及HOXA1基因在Ⅰ型子宫内膜癌组织中高表达,HOTAIRM1与HOXA1的表达呈显著正相关,且两者表达水平与患者FIGO分期和淋巴结转移呈显著正相关,提示两者与Ⅰ型子宫内膜癌的发生发展密切相关。2、LncRNA HOTAIRM1及HOXA1基因可显著提高Ⅰ型子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖能力,并增强裸鼠皮下成瘤及生长能力;两者可增加Cyclin D1的表达调控细胞周期进程;可上调N-cadherin、下调E-cadherin的表达,增强细胞的迁移和侵袭能力。3、HOTAIRM1可上调HOXA1的表达,可能通过激活NF-κB信号通路促进Ⅰ型子宫内膜癌的发生发展。