肝细胞肝癌(HCC)是我国恶性肿瘤死亡的主要原因之一,随着靶向药物如索拉非尼、阿帕替尼等的出现,其预后得到一定改善,但5年生存率依然较低。新的治疗方式的发现依赖于对肝癌发生发展相关机制的进一步理解。长链非编码RNAs(LncRNAs(Long noncoding RNAs))是一种长度超过200个nt的非编码RNA。研究表明LncRNAs参与细胞增殖、凋亡、迁移、自噬、干性维持等多个生理过程。LncRNAs表达和功能的异常通过影响细胞增殖、抗凋亡、肿瘤侵袭转移、肿瘤耐药等生物学行为进而导致多种肿瘤的发生。目前为止,LncRNAs在肝癌中的表达、功能及机制仍不完全明确,需要进一步深入研究。鉴于LncRNA在细胞活动中的重要作用,对肝癌相关LncRNA的功能及其与肿瘤发生发展的关系的研究,探究其上下游可能的效应分子,明确其可能的信号通路,为肝癌的生物靶向治疗提供新的治疗靶点,可能改善肝癌的预后。本课题拟研究LncRNA HOTAIRM1在肝癌中的表达情况、生物学功能以及可能的机制。第一部分LncRNA HOTAIRM1在肝癌中的表达及临床预后的关系目的:旨在研究非编码RNA(LncRNA)HOTAIRM1在肝癌组织及细胞系中的表达情况以及HOTAIRM1表达情况与临床预后的关系。方法:收集肝癌组织及对应癌旁组织标本,对收取的肝癌及癌旁正常组织标本行Q-PCR检测HOTAIRM1在肝癌组织及癌旁组织的表达行统计学分析,使用Kaplan-Meier检验HOTAIRM1与总生存期(OS)的关系。用qPCR法分析HOTAIRM1在正常肝细胞系(L02)及肝癌细胞系(HepG2、HBG11、HHCC)的表达情况。结果:1.Q-PCR结果提示LncRNA HOTAIRM1在肝癌组织及细胞系中低表达。2.ROC曲线表明LncRNA HOTATRM1对HCC诊断具有高灵敏度和特异性。3.LncRNA HOTAIRM1低表达状态常提示预后不良。小结:LncRNAHOTAIRM1基因在肝癌组织和肝癌细胞株中低表达并提示预后不良。第二部分LncRNA HOTAIRM1在肝癌中的生物学功能研究目的:进一步研究LncRNA HOTAIRM1在肝癌中的生物学功能。方法:应用过表达质粒在肝癌细胞株HepG2、HHCC两株肝癌细胞系中过表达HOTAIRM1,体外行细胞功能实验:CCK-8检测细胞增殖及活力、流式细胞术检测细胞凋亡阐明HOTAIRM1基因对肝癌细胞生物学行为的影响。结果:1.过表达LncRNA HOTAIRM1后肝癌细胞增殖明显降低。2.KEGG通路富集分析提示HOTAIRM1的功能主要在凋亡途径中富集。3.利用流式细胞术行凋亡检测提示过表达HOTAIRM1后凋亡增加。小结:过表达LncRNA HOTAIRM1后肝癌细胞增殖减低,同时细胞凋亡增加。第三部分过表达LncRNA HOTAIRM1基因抑制肝癌细胞增殖的机制研究目的:前两部分我们的数据证实HOTAIRM1在肝癌中低表达,过表达HOTAIRM1后肝癌细胞增殖减低及细胞凋亡增加。本部分我们进一步探讨过表达HOTAIRM1基因抑制肝癌细胞增殖的机制。方法:Western blot验证HOTAIRM1过表达前后细胞凋亡蛋白及wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达情况。分别构建FOP、TOP质粒,行双萤光素酶报告基因检测wnt/β-catenin信号通路活性。结果:1.HOTAIRM1过表达可降低抑制凋亡相关基因的表达同时增加促凋亡基因的表达。2.过表达HOTAIRM1后wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达减少。双荧光素酶报告基因检测结果提示过表达HOTAIRM1后wnt/β-catenin信号通路活性降低。小结:LncRNA HOTAIRM1可影响细胞凋亡,通过调控wnt/β-catenin信号通路进而调节细胞增殖。结论:LncRNA HOTAIRM1在肝癌组织及细胞系中低表达,ROC曲线表明LncRNA HOTATRM1对HCC诊断具有高灵敏度和特异性。且此种低表达状态常提示预后不良。过表达LncRNA HOTAIRMI后肝癌细胞增殖明显降低,KEGG通路富集分析提示HOTAIRM1的功能主要在凋亡途径中富集,利用流式细胞术行凋亡检测提示过表达HOTAIRM1后凋亡增加。HOTAIRM1过表达可降低抑制凋亡相关基因的表达同时增加促凋亡基因的表达。过表达HOTAIRM1后wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达减少同时双荧光素酶报告基因检测结果提示过表达HOTAIRM1后wnt/β-catenin信号通路活性降低。总之,LncRNA HOTAIRM1可能通过wnt/β-catenin信号通路调节肝癌细胞增殖。