论文部分内容阅读
1.研究背景血管钙化（Vascularcalcification）主要是指心血管组织中钙和磷的沉积,其表现为血管顺应性的下降和僵硬性的增高,容易诱发心衰、急性血栓栓塞、心肌缺血等心脑血管相关疾病。目前普遍认为血管钙化是一种可预防调节的主动性病理过程,而血管平滑肌细胞向成骨细胞的转化是其最重要的中间环节,主要表现为平滑肌特异性基因（如α-SMA和SM22等）的表达下降和成骨性特异性基因（如Runx2、Msx2、ALP等）的表达上调。可参与血管钙化进程的因素有很多,但具体机制仍在探索中,加强其机制研究,对于临床防治血管钙化及其相关疾病具有重要意义。高迁移率族蛋白（HMG,high mobility group）在血管钙化调节中亦处于极其重要的位置,可通过多种信号通路影响血管钙化相关病理过程的发生和发展。HMG最早于1973年在牛胸腺中被提取,由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移能力超高而得名与此。依据分子量的不同和DNA结构的差异,它被分为三个族群:HMGA、HMGB 和 HMGN,而 HMGB 族群又被分为 HMGB1、HMGB2 和 HMGB3,其中HMGB1的含量最为丰富。HMGB1具有高度保守性,首先体现在氨基酸序列上,其含有219个氨基酸残基,不同物种间同源性高达98%以上;另外,在结构上,HMGB1蛋白被分成3个结构域,分别为A盒、B盒和C尾。目前已知,HMGB1主要位于细胞核内,其主要的生物学功能就是结合DNA,作为细胞骨架蛋白参与转录过程的调节,但是一旦出现应激刺激,其可向细胞质转移,发挥其促炎、促肿瘤形成等生物学效应。此外,HMGB1还可参与凝血和血管内皮细胞功能的调控。肝激酶B1（LKB1）是一种抑癌基因,也被称为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 1（STK11）,它主要存在于细胞核内,在哺乳动物中广泛表达。LKB1蛋白含有433个氨基酸,由3个结构域组成:激酶区域、N端和C端。目前已知,LKB1是重要的蛋白激酶,可直接磷酸化AMPK使其激活,从而发挥抑癌、调控能量转换等生物学功能。此外,LKB1可以调控血管内皮生长因子的表达和血管新生,LKB1还可调节内皮舒张功能和血压稳定。这提示:LKB1与心血管系统疾病之间存在相关联系。然而,目前尚无文献显示LKB1可以在血管钙化中发挥作用,本课题旨在探讨两者之间的关系。2.研究目的（1）研究LKB1对小鼠平滑肌细胞钙化的影响;（2）阐明小鼠平滑肌特异性敲除LKB1对血管钙化的影响;（3）探讨LKB1调控平滑肌钙化的具体分子机制。3.研究方法（1）动物模型构建:LKB1flox/flox小鼠与SM22-CreERT2小鼠杂交可得LKB1flox/flox/Cre十小鼠,6周龄时给予连续5天腹腔注射他莫西芬（每只小鼠每天1mg）处理,可构建出LKB1SMKO小鼠。另外,同窝的LKB1flox/flox/Cre-小鼠接受相同剂量他莫西芬处理后作为对照组（CTR）。上述实验小鼠,在8周龄时给予连续4天皮下注射维生素D（VD3）处理,构建血管钙化模型。为了探究LKB1敲除对小鼠血管钙化的作用,设置以下4组:①CTR+Vehicle;②LKB1SMKO+Vehicle;③CTR+VD3;④LKB1SMKO+VD3。为了验证LKB1对小鼠血管钙化的影响是通过HMGB1而实现的,给小鼠注射HMGB1抑制剂（GA）,并设置以下4组:①CTR+VD3+Vehicle;②LKB1SMKO+VD3+Vehicle;③CTR+VD3+GA;④LKB1SMKO+VD3+GA。（2）细胞模型:培养小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）,分别感染LKB1和GFP（对照）的病毒,然后用高磷酸盐溶液（高Pi）处理6天诱导其发生钙化。为了进一步探究LKB1对小鼠血管平滑肌细胞钙化的生物学效用,设置以下4组:①GFP+Vehicle;②LKB1+Vehicle;③GFP+Pi;④LKB1+Pi。此外,提取LKB1SMKO和CTR小鼠原代VSMCs,然后用高Pi处理6天从而诱导其钙化,并分为 4 组:①CTR+Vehicle;②LKB1sMKO+Vehicle;③CTR+Pi;④LKBlSMKO+Pi。（3）探究多种钙化条件刺激下LKB1的表达变化:分别用高Pi、高糖、醛固酮和地塞米松处理VSMCs,检测LKB1蛋白和mRNA表达水平的变化;检测与相应的对照相比,钙化小鼠LKB1蛋白和mRNA表达水平的变化以及血管钙化病人的主动脉中LKB1表达水平的变化;另外,用尿毒症病人血清刺激VSMCs后检测LKB1的表达变化。（4）探索LKB1对高Pi诱导的血管平滑肌细胞钙化的效用:培养VSMCs,分别感染LKB1和GFP（对照）病毒,给予高Pi刺激6天,检测平滑肌细胞中Runx2的蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a、Wnt7a的mRNA表达水平的变化。另外,提取6-8周龄LKB1SMKO和CTR小鼠原代VSMCs,给予高Pi刺激,检测上述钙化相关指标。（5）研究LKB1对维生素D诱导的小鼠血管钙化的作用:给予8周龄的各实验组小鼠连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Vonkossa染色评价小鼠主动脉弓的钙化面积;Western blot评价Runx2的蛋白表达水平的变化;组织钙含量、血清钙含量和血清ALP活性的检测评价血管钙化程度。（6）探讨LKB1HMGB1的调控作用:在VSMCs中敲除或过表达LKB1,利用western blot、RT-PCR、ELISA和免疫组化技术检测HMGB1的表达变化;进行免疫共沉淀实验明确LKB1是否能与HMGB1直接结合;另外,利用蛋白降解途径实验去验证LKB1通过何种途径影响HMGB1的表达。（7）验证HMGB1在LKB1调控血管钙化中的作用:在感染LKB1或GFP病毒的VSMCs中过表达HMGB1,并给予高Pi刺激6天,检测前述钙化相关指标。在LKB1SMKO和CTR小鼠中腹腔注射HMGB1抑制剂（GA）,并连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Vonkossa染色评价小鼠主动脉弓的钙化面积;Western blot评价Runx2的蛋白表达水平的变化;组织和血清的钙含量和ALP活性检测用以评价血管钙化程度。4.研究结果（1）在多种钙化条件刺激下,LKB1的表达下调。首先我们分别用高Pi、高糖、醛固酮和地塞米松处理VSMCs,发现LKB1蛋白和mRNA的表达水平明显降低。接着,我们发现与对照小鼠相比,钙化小鼠血管LKB1蛋白和mRNA的表达水平显著下降。同样地,免疫组化显示:与对照相比,血管钙化病人主动脉的LKB1表达水平亦减少。此外,VSMCs经尿毒症病人血清刺激后LKB1的表达水平也是降低的。（2）LKB1抑制了高Pi诱导的小鼠血管平滑肌细胞的钙化。在血管平滑肌细胞中分别感染LKB1和GFP病毒,给予高Pi刺激6天,发现与对照组相比,过表达LKB1显著降低了由高Pi诱导的Runx2蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a和Wnt7a的mRNA表达水平的增加。另外,提取LKB1SMKO和对照小鼠原代VSMCs,给予高Pi刺激,发现与对照小鼠相比,LKB1SMKO增强了高Pi诱导的血管钙化。（3）LKB1敲除促进了维生素D对小鼠血管钙化的诱导作用。对8周龄的各实验组小鼠,连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Von kossa染色发现:LKB1SMKO小鼠主动脉弓的钙化面积明显大于对照小鼠;Western blot显示:LKB1SMKO小鼠的Runx2蛋白水平高于对照小鼠。另外,LKB1SMKO小鼠的组织钙含量、血清钙含量和血清ALP活性亦明显高于对照小鼠。（4）LKB1直接结合HMGB1,并通过溶酶体途径促进了它的降解。利用western blot、RT-PCR、ELISA和免疫组化技术,我们发现:过表达LKB1降低了 HMGB1的蛋白水平和分泌水平,而敲除LKB1则明显提高了 HMGB1的水平。免疫共沉淀实验显示LKB1能与HMGB1直接结合;另外,蛋白降解途径实验证实LKB1是通过溶酶体途径促进HMGB1的降解的。（5）LKB1通过HMGB1发挥其抑制血管平滑肌钙化的作用。在感染了LKB1和GFP（对照）病毒的VSMCs中过表达HMGB1,并给予高Pi刺激6天,结果发现,过表达HMGB1可以明显缓解LKB1对Runx2的蛋白表达、钙沉积、钙含量、碱性磷酸酶活性以及Runx2、ALP、Msx2、Wnt3a、Wnt7a等mRNA表达水平的抑制作用。在LKB1SMKO和对照小鼠中注射HMGB1的抑制剂,接着连续4天皮下注射维生素D,10天后取材。茜素红染色和Von kossa染色显示:注射HMGB1抑制剂后,可以显著减少LKB1SMKO和对照小鼠主动脉弓增加的钙化面积;Western blot显示:注射HMGB1的抑制剂后,LKB1SMKO和对照小鼠增加的Runx2的蛋白表达水平被有效下调;此外,组织和血清的钙含量和ALP活性亦明显减少。5.结论（1）LKB1可以抑制高磷诱导的血管平滑肌钙化;（2）LKB1可以与HMGB1直接结合,并通过溶酶体途径促进其降解,导致其表达水平下降,从而发挥抑制血管钙化的作用。