论文部分内容阅读
背景和目的:恶性肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机制破坏的疾病,表现为细胞周期失调、信号传导途径异常。生物进化过程中,细胞建立了一系列的调控机制,以确保细胞周期各时相严格有序地进行。不受控制的细胞增殖是恶性肿瘤的最重要特征;多数恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关。因此,对细胞周期调控机制和肿瘤细胞周期调控改变的深入研究,不仅有助于认识肿瘤发生和演进,还将为肿瘤治疗开辟崭新的思路。LKB1(Liver Kinase B1)基因是肿瘤易患综合征—PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome, PJS)的致病基因,在高达90%的PJS病人中可检测到LKB1基因的胚系突变。LKB1基因的功能异常还与全身多种散发性肿瘤的发生密切相关,如在30-40%的非小细胞肺癌、20%宫颈癌、19%鳞状细胞癌以及13%乳腺侵润性导管癌中均有LKB1基因的失活。LKB1基因在恶性肿瘤发生中起着重要作用,研究证实LKB1能够使细胞周期停滞在G1期,抑制细胞生长,但其机理尚不清楚。本课题通过构建靶向LKB1基因的siRNA质粒、LKB1基因野生型表达质粒和LKB1基因无激酶活性的突变型表达质粒,将重组质粒转染人正常细胞株和癌细胞株,观察LKB1的蛋白表达和激酶活性对细胞周期的影响,分析其中重要分子的表达和活性变化,以建立抑癌基因LKB1调控细胞周期的信号通路模型,揭示LKB1抑制细胞恶性增殖的分子背景。方法:(1)构建靶向LKB1基因的3个siRNA表达质粒,脂质体介导转染HEK293T和HUVEC细胞,免疫组化、western blot验证siRNA质粒对LKB1表达的沉默效果,流式细胞术研究HEK293T和HUVEC细胞LKB1表达沉默后细胞周期的变化,western blot检测细胞周期主要的调控组分Rb、磷酸化Rb、cyclin D1、cyclin E、p53、p21和p16的蛋白水平。(2)将LKB1基因野生型表达质粒转染不表达LKB1的Hela细胞,通过G418抗性筛选获得稳定转染LKB1基因的Hela细胞系,流式细胞术研究LKB1蛋白稳定表达对Hela细胞细胞周期的影响,western blot检测磷酸化Rb、PCNA、AMPKα及磷酸化AMPKα的蛋白水平,分析AMPK抑制剂Compound C对PCNA表达的影响。(3)通过体外定点突变技术,将LKB1蛋白激酶催化域第78位赖氨酸的编码碱基突变为甲硫氨酸的编码碱基,构建无激酶活性的突变型LKB1基因表达质粒,将LKB1基因野生型质粒和突变型质粒转染HEK293T细胞后,流式细胞术研究细胞周期的变化,western blot检测磷酸化Rb、PCNA、AMPKα及磷酸化AMPKα的蛋白水平。结果:(1)成功构建靶向LKB1基因的3个siRNA表达质粒,转染HEK293T和HUVEC细胞后,3个干扰质粒均能有效沉默LKB1蛋白表达,其中干扰质粒pshRNA-1和pshRNA-3效果尤为明显(抑制率>70%)。HEK293T和HUVEC细胞内源性LKB1表达沉默后,细胞G1期比例明显下降,S期比例增加,Rb蛋白的磷酸化水平显著增强,p53和p16表达显著减弱,而总Rb蛋白、cyclin D1、cyclin E表达水平无明显变化。(2)成功构建稳定转染LKB1基因的Hela细胞系,LKB1蛋白稳定表达的Hela细胞G1期比例明显增加,S期比例减少,Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表达水平明显降低,AMPKα的磷酸化水平明显增强,当用Compound C抑制Hela稳定株细胞AMPK活性后,PCNA蛋白表达水平明显提高。(3)成功构建无激酶活性的突变型LKB1基因表达质粒,与空质粒转染组细胞相比,转染LKB1野生型质粒的HEK293T细胞G1期比例明显增加,S期比例减少,Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表达水平明显降低,AMPKα的磷酸化水平明显增强,而LKB1突变型质粒转染细胞后无明显变化。结论(1)在HEK293T和HUVEC细胞中沉默内源性LKB1表达通过下调p53和p16表达水平,促进Rb蛋白的磷酸化,推动细胞周期从G1期进入S期,加速细胞增殖。(2)在Hela细胞中稳定表达LKB1蛋白通过磷酸化激活AMPK,抑制Rb蛋白的磷酸化,使细胞周期停滞在G1期,抑制细胞增殖。(3)在HEK293T细胞中增强LKB1表达通过磷酸化激活AMPK,抑制Rb蛋白的磷酸化,使细胞周期停滞在G1期,抑制细胞增殖;当LKB1基因突变丧失激酶活性后,抑制作用消失。