山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的研究

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杨树作为用材、防风、绿化的主要树种,在我国各省、区具有广泛分布和大面积栽培。由于杨树的病虫害种类多、危害重,常常给我国的林业生产和生态建设造成巨大的经济损失。当前人类的生态和环境安全意识日益提高,大量使用化学农药防治病虫害将受到限制,生物防治的措施又比较薄弱,杨树有害生物可持续控制将是森林保护领域面临的问题。本研究以山新杨为受体,采用农杆菌介导法将Bt+蜘蛛杀虫肽抗虫基因导入该受体中,不仅为山新杨的遗传转化及抗性育种提供了理论基础,同时为山新杨抗虫品种(系)的扩繁和野外栽培提供了繁殖材料。1.通过测定不同浓度头孢对山新杨叶片愈伤组织形成及分化的影响,认为山新杨叶片对头孢噻肟钠具有一定的抗性,筛选培养中加入浓度为600mg/L的头孢霉素不会对山新杨叶片愈伤形成和分化产生不利影响。2.卡那霉素对山新杨叶片分化和诱导生根所能忍受的临界浓度为10mg/L,高于该浓度即可抑制山新杨叶片的分化;卡那霉素对山新杨诱导生根所能忍受的临界浓度为15mg/L,浓度达20mg/L以上时,组培苗的生长明显受到抑制。3.在进行山新杨遗传转化时,预培养时间以2~3d为最好,2d的抗性芽率为23.3%,3d的抗性芽率为20%。预培养时间低于2d和大于4d抗性芽率下降。4.菌液浓度过高会使受体材料迅速褐化死亡,菌液浓度过低转化抗性芽率低或为零,适宜于山新杨转化的菌液浓度为OD600=0.1~0.2。侵染时间在2~5min有利于山新杨叶片的遗传转化。在菌液浓度一定时,侵染2~5min抗性芽率随时间的增加而提高。侵染5min以上时,虽叶片的分化率较高,但是形成的抗性芽较低。5.共培养时间以2~3d为宜,4d以上不仅假阳性芽增加,而且外植体生长变弱、叶片和芽黄化。6.优化了山新杨遗传转化系统,预培养2~3d、OD600=0.1~0.2菌液侵染2~5min、共培养2~3d和共培养培养基中添加200μmol/LAS为山新杨遗传转化的最佳组合。7.共侵染山新杨叶盘1570个,获得抗性芽植株86个,经PCR检测共获得21株转基因阳性植株,PCR检测阳性率达24.42%。PCR-Southern检测表明有21株显示出杂交信号,阳性率为100%,转化率为1.34%。
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