随着多学科综合研究的不断深入,人们逐渐认识到肿瘤是一种系统性疾病,机体的精神状态、神经、免疫、内分泌系统对肿瘤的发生、发展和预后有着重要的影响。因此,从机体的系统调控网络出发,研究可能影响肿瘤发生、发展的因素及其机制,将为肿瘤的防治提供新的思路。精神应激对机体的系统调控网络具有重要的调节作用,其过程包括一系列的精神行为及机体机能的改变,从而对肿瘤发生发展产生的重要影响。精神应激可分为良性应激（Eustress）和恶性应激（Distress）,目前对于精神应激和肿瘤关系的研究主要集中于恶性应激。抑郁症作为典型恶性应激与一些肿瘤的高发有密切关系,而且临床上应用精神药物缓解癌痛引起的抑郁状态已成为癌症支持治疗的重要环节。然而,良性应激对肿瘤发生发展的作用及机制尚研究甚少。丰富生存环境（Enriched Environment,EE）作为一种被普遍接受的良性应激模型,较常规饲养环境有更大的空间、更多的成员以及更为丰富新奇的玩具设施,它不仅给小鼠提供了更多的感官刺激及运动机会,而且赋予了小鼠间社交行为的可能,其对于小鼠神经系统具有多方面的正向作用,如促进小鼠神经再生和重塑,改善小鼠的抑郁状态,减少小鼠的焦虑行为,促进脑损伤后的神经恢复等。最近,EE对肿瘤的影响开始受到人们的关注。我们实验室先前已证实,在C57BL/6雄性小鼠皮下移植瘤模型中,EE对Panc02胰腺癌、B16F10黑色素癌和Lewis肺癌均有明显抑制作用。然而,EE对肿瘤的作用尚有待于在不同的肿瘤模型中进一步证实。同时,EE抑瘤作用的机制及对肿瘤治疗的转化意义还缺乏深入研究。本课题中,我们拟对以下三方面内容进行研究:1.在实验室对EE抑制皮下移植瘤的研究基础上,建立小鼠MC38皮下移植性结肠癌模型、小鼠Panc02原位移植性胰腺癌模型、APCMin+小鼠肠微腺瘤模型,进一步证实EE对肿瘤的普遍抑制作用;2.探讨EE对肿瘤化疗敏感性的影响,并进一步研究EE影响化疗药敏性的作用机制;3.在明确EE改变小鼠精神行为的基础上,进一步探讨精神行为对肿瘤发展的作用。本课题进一步确认了EE能普遍抑制肿瘤的发生发展,并首次发现EE对肿瘤化疗具有增敏作用,这种作用可能由膜转运蛋白所介导。此外,通过动物学实验,揭示了焦虑抑郁等性格行为对肿瘤生长的促进作用,EE及抗焦虑类精神药物具有肿瘤抑制作用。本课题结果,支持了神经精神因素对肿瘤的发生发展具有重要的调控作用,提示未来的肿瘤治疗策略由局部向整体转移的重要性。第一部分丰富生存环境对肿瘤发生及发展的影响目的:建立EE小鼠MC38皮下移植性结肠癌模型、Panc02原位移植性胰腺癌模型、APCMin+肠微腺瘤模型,观察良性精神行为因素对小鼠肿瘤发生发展的影响方法:3周龄雄性C57BL/6小鼠随机置于EE（12只/笼）或标准环境（Standard environment,SE;4只/笼）中饲养3周,皮下接种MC38结肠癌或原位接种Panc02胰腺癌后,继续在原有环境中饲养3-5周。动物实验终止时,称取瘤重并计算抑瘤率。3周龄APCMin/+小鼠随机置于EE或SE环境中,饲养条件同上,20周龄时处死小鼠并留取肠道标本,统计肠道腺瘤的数目和体积。结果:EE对MC38皮下移植性结肠癌（SE组0.85±0.14g v.s.EE组0.41±0.08g,P<0.01）和Panc02原位移植性胰腺癌（SE组0.15±0.02g v.s.EE组0.09±0.01g,P<0.01）有明显的抑制作用,抑瘤率分别达到52.2%和43.3%。在APCMin/+小鼠肠微腺瘤模型中,EE饲养能够显著抑制小鼠肠道内腺瘤个数（SE组24.17±1.19个/鼠v.s.EE组为18.08±1.75个/鼠,P<0.01）和肠道内腺瘤体积（SE组139.07±13.57mm~3 v.s.EE组86.70±10.32mm~3,P<0.01）,抑制率分别为25.2%和37.7%。结论:综合实验室前期工作及本研究结果,EE对C57BL/6小鼠肿瘤具有广泛且显著的抑制作用。第二部分丰富生存环境对肿瘤化疗敏感性的影响目的:研究EE对小鼠肿瘤化疗敏感性的影响,并探索其可能机制。方法:3周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:SE-PBS组、SE-5FU组（于标准环境饲养,4只/笼）和EE-PBS组、EE-5FU组（丰富生存环境饲养,12/笼）。饲养3周后皮下接种Panc02胰腺癌,瘤体积>1mm~3时治疗组进行小剂量5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5FU）腹腔注射,对照组腹腔注射PBS。于皮下移植瘤建模后第5周处死小鼠进行肿瘤称重及标本采集。在进一步实验中,通过观察EE对Panc02皮下移植性胰腺癌对或吉西他滨（Gemcitabine,GEM）及MC38皮下移植性结肠癌对5FU化疗敏感性的影响,验证EE与化疗药物协同作用的广泛性,方法同上。为进一步明确EE与化疗药物协同作用,我们分别对EE组及SE组小鼠Panc02皮下移植肿瘤进行了原代细胞培养,并检测其对5FU或GEM的半抑制浓度(Inhibitory concentration 50%,IC50)。为探讨EE影响化疗敏感性的作用及机制,分别抽提EE组及SE组Panc02皮下移植性胰腺癌体组织总RNA并纯化后进行小鼠全基因组表达谱芯片检测。将芯片结果中与药物代谢及转运相关的基因中进行了Real-time PCR及蛋白水平的验证。通过过表达或是RNA干扰,上调或是下调受EE影响的基因的表达,在体外和体内观察该基因表达改变对肿瘤化疗敏感性的影响。结果:在EE对Panc02-5FU药敏性体内实验中,SE-PBS组、SE-5FU组、EE-PBS组、EE-5FU组小鼠皮下移植瘤重量分别为0.629±0.027g、0.530±0.04g、0.375±0.021g、0.203±0.015g;其中SE-5FU与EE-PBS比较无明显差异（P=0.082）,其余两两比较有显著差异（P<0.05）。对抑瘤率进行分析提示,同剂量5FU在EE中的效果由15.8%提高至45.9%。EE与化疗药物协同作用的广泛性验证中EE环境下5FU对MC38皮下移植性结肠癌的抑瘤率从17.22%提高到34.38%（P<0.05）,而EE环境下GEM对Panc02皮下移植性胰腺癌抑瘤率为50.21%,较SE环境（29.28%）明显提高（P<0.05）。在离体条件下,原代细胞水平的研究结果提示,EE小鼠来源的Panc02原代细胞对5FU的敏感性显著高于SE小鼠来源的细胞,以10-5M浓度的5FU处理48小时后,SE小鼠来源的原代Panc02细胞存活率为39.99±4.73%,而EE小鼠的原代肿瘤细胞存活率仅为30.32±2.15%（P<0.05）。瘤体中基因表达谱分析显示,药物敏感性相关转运基因改变多集中于ABC蛋白转运通路和GST通路:ABCA8A,ABCA8B,ABCC9,ABCC1,ABCG2,GSTK,GSTM1,GSTM3,GSTM4等。对芯片结果进行定量PCR及Western bolt验证,ABCA8A、ABCA8B的mRNA及蛋白水平在EE组出现明显下调。通过慢病毒转染成功构建ABCA8A、ABCA8B过表达细胞株（Panc02-ABCA8A和Panc02-ABCA8B）,体外和体内实验结果均显示ABCA8A可显著降低Panc02细胞对化疗药物的敏感性。以5FU(浓度为10-5M)或GEM(浓度为10-6M)处理细胞48小时后,Panc02-ABCA8A细胞存活率（5FU组:58.86±3.23%;GEM组:58.16±4.37%）明显高于对照细胞（5FU组:37.56±0.47%,P<0.05;GEM组:39.25±1.18%）。但是,Panc02-ABCA8B在5FU及GEM处理下细胞存活率（5FU组:47.57±0.75%;GEM组:50.58±1.97%）,与对照细胞比均无明显差异。C57BL/6小鼠皮下接种ABCA8A、ABCA8B过表达细胞株及对照细胞后,用5FU腹腔注射进行治疗,Panc02-ABCA8A组的5FU抑瘤率为20.44%,明显小于对照组（57.19%,P<0.05）;而Panc02-ABCA8B组的5FU抑瘤率为33.74%,与对照组比无明显差异（P>0.05）.同时,我们用表达针对ABCA8A的RNA干扰序列的慢病毒感染Panc02胰腺癌细胞,成功构建了ABCA8A低表达细胞株（Panc02-siABCA8A）。与过表达结果相反,下调ABCA8A能显著提高Panc02胰腺癌细胞对5FU敏感性。以10-5M浓度的5FU处理48小时后,Panc02-siABCA8A细胞存活率为27.67±1.52%,明显低于对照组（40.56±4.77%,P<0.05）。结论:EE能通过下调肿瘤细胞膜转运蛋白ABCA8的表达,从而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。第三部分精神行为对肿瘤生长的影响目的:明确丰富生存环境对小鼠精神行为的影响,探索小鼠精神行为对肿瘤生长的作用。方法:建立小鼠焦虑、抑郁及社交的行为学测试方法如下:1.高架十字迷宫试验（Elevated Plus Maze,EPM）:主要指标是开放臂活动时间和开放运动路程占比,可反映小鼠的焦虑状态;2.旷场试验（Open Field,OF）:主要指标为中央区活动时间,反映小鼠的探索能力;3.强迫游泳（Forced swimming,FS）:主要指标为静息状态时间,反映小鼠的绝望状态。上述实验中小鼠行为用CCD摄像头记录,数据通过Supermaze软件分析统计。为明确EE对C57BL/6小鼠焦虑样行为的影响,EE小鼠和SE小鼠在4周龄、7周龄及9周龄（荷瘤2周）时,进行EPM实验,观察开放臂活动时间及开放臂活动路程占比等指标。初步筛选影响胰腺癌生长的精神行为,将4周龄雄性C57BL/6小鼠进行EPM、OF和FS试验,记录每只小鼠的各项行为学指标。于7周龄时皮下接种Panc02胰腺癌细胞,5周后称取瘤重,将行为学指标与瘤重进行相关性分析。为了进一步验证小鼠焦虑样行为对胰腺癌生长的作用,将4周龄雄性C57BL/6小鼠进行EPM试验,按开放臂时间分为开放臂高活性组（开放臂活动时间长,焦虑程度低）、开放臂中活性组（开放臂活动时间中等,焦虑程度中等）和开放臂低活性组（开放臂活动时间短,焦虑程度高）。在SE环境下饲养3周后,皮下接种Panc02胰腺癌细胞,接种10天后每5天测量小鼠的体积,观察肿瘤生长情况。同时,在接种时和接种2周时再次进行EPM试验,明确各组间小鼠焦虑行为的差异。为了进一步证实小鼠焦虑样行为对胰腺癌生长的影响,我们观察了抗焦虑药物氟西汀和喹硫平改变小鼠的焦虑样行为后对外周胰腺癌生长的影响。4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、氟西汀组和喹硫平组,对照组给予常规的饮用水,而氟西汀组和喹硫平组分别在饮用水中加入相应的精神类药物。用药3周后（7周龄）皮下接种Panc02皮下胰腺癌细胞,接种10天后每5天测量小鼠的体积,观察肿瘤生长情况。同时,在接种时和接种2周时再次进行EPM试验,明确药物对小鼠焦虑行为的改变。结果:与文献报道一致,EE饲养3周后可明显改善小鼠的焦虑状态,延长了小鼠的开放臂活动时间（EE组94.55±11.40sec v.s.SE组53.67±5.20 sec,P<0.05）及开放臂路程占值（SE组8.24%v.s.EE组16.38%,P<0.05）。在小鼠精神行为与胰腺癌生长的相关性初步研究中,我们发现Panc02皮下移植性胰腺癌重量和小鼠在EPM试验中开放臂活动呈显著的负相关（P<0.05）（P<0.05）,而和旷场试验以及强迫游泳试验的行为学指标无相关性（P>0.05）,提示焦虑样行为可能促进皮下移植性胰腺癌的生长。在进一步实验中,我们根据4周龄小鼠的EPM开放臂活动时间将其分为开放臂高、中、低活性组,在7周龄和9周龄时证实开放臂高活性组小鼠的焦虑行为明显低于开放臂中活性组和开放臂低活性组（P<0.01）。肿瘤生长情况与预期结果一致,开放臂高活性组小鼠的Panc02皮下移植性胰腺癌生长显著慢于开放臂中活性组和开放臂低活性组（P<0.01）。但是,开放臂中活性组小鼠的肿瘤体积略小于开放臂低活性组,没有明显差异（P>0.05）。这一结果提示了焦虑行为对胰腺癌生长具有促进作用。通过抗焦虑类精神药物改变小鼠行为,进一步证实了焦虑行为对胰腺癌生长具有促进作用。氟西汀和喹硫平处理在肿瘤接种前后,均能降低小鼠在EPM实验中的焦虑样行为。对肿瘤生长情况分析发现,氟西汀与喹硫平组肿瘤体积比对照组明显减小（氟西汀组98.93±10.92 mm~3&喹硫平组117.57±29.41 mm~3 v.s.对照组220.28±34.34 mm~3,P<0.01）。结论:焦虑行为能促进胰腺癌的生长,通过改变生活环境或抗焦虑精神药物改善焦虑状态可能对胰腺癌的辅助治疗具有转化医学的意义。