RNA结合蛋白hnRNPA2/B1调控大鼠肠神经嵴干细胞增殖凋亡、迁移作用的实验研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:simuwuzx
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:肠神经系统(Enteric nervous system,ENS)是由肠壁内的神经元和神经胶质细胞构成的网络系统,其发育异常会引起胃肠道严重的功能紊乱或畸形,但具体调控机制尚不清楚。实验组前期研究应用蛋白质组学筛选发现在先天性巨结肠(Hirschsprung disease,HSCR)患者中核糖不均一核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2/B1)呈高表达。hnRNPA2/B1属于RNA结合蛋白家族的一员,主要通过影响m RNA稳定性和可变剪接发挥作用,在多种恶性肿瘤中均存在差异性表达,介导上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)参与恶性肿瘤的发生进展,但目前尚未有关肠神经系统发育调控机制的研究报道。肠神经系统发育由肠神经嵴干细胞由头端向尾端迁移、增殖分化并定植于肠道,本实验组前期实验证实EMT在大鼠肠神经嵴干细胞发育过程中发挥重要作用。EMT是胚胎发育的基础,对于机体组织和器官的分化具有至关重要的作用。ZEB家族是重要的EMT转录因子,通过结合E-钙蛋白的启动子区域,促进EMT的发生,但是HNRNPA2B1与ZEB家族的关系以及是否可以诱导EMT发生尚不清楚。因此,本研究首次在大鼠肠神经嵴干细胞(Enteric neural crest stem cells,ENCSCS)中,运用实时定量PCR(Reverse Transcription PCR,RT-PCR)、免疫印迹法(Western-Blotting,WB)、细胞增殖实验(cck-8法)、细胞凋亡实验(AV/PI流式检测法)、细胞迁移实验(transwell)等实验证实hnRNPA2/B1参与大鼠肠神经嵴干细胞发育,通过RNA免疫沉淀法(RNA-Immunoprecipitation,RIP)探讨hnRNPA2/B1介导EMT在肠神经系统发育中的调控机制。研究方法:1、ENCSCs分离培养健康成熟未孕的Wistar大鼠,按雌雄3:1比例午夜合笼,第二天上午做雌鼠阴道涂片,显微镜下观察发现精子或肉眼发现阴栓掉落,确认已交配怀孕,此日计妊娠0天(embryonic day0,E0)。取妊娠12天(embryonic day12,E12)的Wistar雌鼠,提取ENCSCS并传代培养。2、构建大鼠hnRNPA2/B1病毒载体,设计大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒,qRT-PCR和WB筛选出干扰效果最佳的腺病毒进行下一步转染实验。3、运用RNA干扰技术(RNA Interfernce,RNAi)转染大鼠肠神经嵴干细胞,敲低hnRNPA2/B1表达,qRT-PCR和WB分别检测在阴性对照组与实验干扰组中EMT标志物E-钙蛋白(E-cadherin)和N-钙蛋白(N-cadherin)、EMT转录因子ZEB1/ZEB2表达情况,RT-PCR检测mir-200c的表达情况。4、利用RNAi敲低大鼠肠神经嵴干细胞中hnRNPA2/B1蛋白表达,通过CCK-8实验、AV/PI流式检测法、transwell实验,分别在阴性对照与实验干扰组中观察大鼠肠神经嵴干细胞的增殖、凋亡、迁移情况。5、在正常大鼠肠神经嵴干细胞中,运用RIP实验验证hnRNPA2/B1与EMT转录因子ZEB1/ZEB2的结合情况。6、统计分析:实验结果以平均数±标准差表示,采用Graph Pad Prism 8.0进行数据分析。结果:1、使用DMEM/F12完全培养基成功培养出妊娠12天的ENCSCs。2、共设计出2对大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒,经过qRT-PCR实验,选取大鼠hnRNPA2/B1干扰腺病毒si RNA1作进一步瞬时转染,WB实验进一步证实hnRNPA2/B1干扰腺病毒si RNA1可以用于干扰hnRNPA2/B1蛋白的表达。3、运用RNA干扰技术,敲低hnRNPA2/B1蛋白表达,qRT-PCR和WB结果一致:与阴性对照组相比,实验干扰组ZEB1/ZEB2表达减少,E-cadherin和mi R-200c表达增加、N-cadherin表达减少。4、通过RNAi敲减hnRNPA2/B1蛋白表达,经qRT-PCR和WB验证:实验干扰组比阴性对照组相比,细胞增殖减慢、凋亡率下降、迁移速度减慢。5、经过RIP实验证实hnRNPA2/B1与ZEB1/ZEB2 m RNA存在直接结合。结论:我们研究结果表明,hnRNPA2/B1影响大鼠肠神经嵴干细胞的增殖、迁移、凋亡过程,并且在大鼠肠神经嵴干细胞中hnRNPA2/B1可与ZEB1/ZEB2 m RNA直接结合,可能通过影响ZEB1/ZEB2 m RNA稳定性调控EMT。提示hnRNPA2/B1参与肠神经系统发育调控。
其他文献
目的:探讨腮腺的体素内不相干运动(IVIM)MR成像在干燥综合征(SS)中的应用价值。研究方法:对35例确诊但尚未治疗的SS患者和35例健康志愿者的双侧腮腺进行MR常规扫描及IVIM序列扫描,获得双侧腮腺的表观扩散系数(ADC)、真实扩散系数(D)、假性扩散系数(D*)及灌注分数(f),并根据MR常规扫描图像对SS患者双侧腮腺进行MR形态学分级。采用非参数Mann-Whitney U检验比较SS患
目的:骨缺损修复是临床常见的问题。传统应用自体、异体骨移植在临床中取得疗效,但应用受到限制。组织工程骨的快速发展成为骨缺损修复的新方法,解决了大量制备及大面积修复问题,这种方法可以克服自体异体骨移植的缺点,包括如供区受损问题、移植后免疫排斥反应问题以及致病性问题等,成为近年来研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSC)是一种可以从体内进行分离、扩
目的:脂肪干细胞(ADSCs)其主要成分来源于脂肪组织中,是间充质干细胞的一种。许多研究证实了ADSCs的成骨分化潜能,并认为ADSCs是有利于骨形成和再生的良好的种子细胞。与骨髓间充质干细胞相比,脂肪干细胞的获取更简单、来源更丰富,含量较多、伦理限制更少。脂肪干细胞由此成为了组织工程修复重建领域中最具应用价值的种子细胞。环状RNA(circ RNAs)是一种非编码RNA。Circ RNAs的表达
目的:网状Meta分析是近些年来在传统Meta分析的基础上发展起来的一种方法学。传统Meta分析只能对两种处理因素之间进行分析比较,网状Meta分析是可以对多种处理因素之间进行比较,并基于排序结果筛选得到最佳的处理因素的方法。目前随机对照试验的网状Meta分析已有多种基于频率学派及贝叶斯学派的分析方法,得到了较为全面的应用及发展。但是由于遗传关联性研究中基因型数据的特点,目前关于遗传关联性研究网状
背景及目的:突触是神经元之间信息传递的关键部位,由突触前膜、突触间隙和突触后膜组成。神经元间的信息单向流动,主要由位于突触前的突触囊泡释放神经递质介导。突触前膜被刺激发生去极化时,突触前膜的钙通道开放,Ca2+内流进入突触前,导致突触囊泡通过胞吐作用与突触前膜融合释放神经递质,随之又通过胞吞作用完成囊泡组分的回收,维持突触囊泡的可持续释放。因此,突触囊泡通过胞吐作用释放神经递质对于神经元之间的信息
目的:雄黄含砷,是《中华人民共和国医疗用毒性药品管理办法》中规定的28种毒性中药之一。临床上因滥用含雄黄的牛黄解毒片而造成慢性砷中毒的事件时有发生,表现为全身多系统损害,其中中枢神经系统是其毒作用的靶器官之一,使含雄黄的牛黄解毒片的安全性受到广泛的质疑,因此,雄黄在牛黄解毒片中的去/留(毒/效)问题成为人们关注的焦点和热点。牛黄解毒片是治疗胃肠积热证的代表药。胃肠积热证与免疫因子分泌失衡导致的炎症
目的:将个案管理模式应用于早产产妇的母乳喂养护理中,评价经护理干预后母乳喂养结局的改善程度,分析该模式在母乳喂养中的应用效果,旨在完善早产产妇母乳喂养的健康管理。研究方法:成立个案管理研究小组;建立早产产妇母乳喂养个案管理流程。选取2020年8月~2020年12月在辽宁省某三级甲等医院产科住院的先兆早产产妇100例作为研究对象。按产妇居住病房楼层分为实验组和对照组。在实施干预前对两组产妇的一般资料
目的:氨基糖苷类抗生素因为其价格低廉,抗菌效果好,现在仍是世界范围应用最广泛的抗生素。但是其在临床应用过程中,具有明显的耳毒性副作用,严重影响患者的生活质量以及为社会经济发展带来沉重负担。大量研究表明氨基糖苷类抗生素诱导的内耳损伤与氧化应激反应有关。氨基糖苷类抗生素进入内耳后会刺激毛细胞内产生大量的活性氧分子(Reactive oxygen species,ROS)。ROS的过度积累会破坏耳蜗毛细
目的:通过贝叶斯网状Meta分析和回顾性研究的方法,综合研究不同新型口服抗凝药物用于房颤消融围术期的疗效与安全性,以期为心房颤动患者消融围术期合理应用新型口服抗凝药和开展临床药学服务奠定循证基础。研究方法:1.采用贝叶斯网状Meta分析的方法探究新型口服抗凝药用于心房颤动患者消融围术期治疗的疗效与安全性。检索数据库Pubmed、Embase、Cochrane Library、CNKI、WANFAN
研究背景和研究目的:社区获得性肺炎(CAP)是最常见的呼吸系统疾病之一,大部分CAP预后良好。少数患者由于高龄或者合并基础疾病可发展为重症肺炎,重症社区获得性肺炎(SCAP)如不及时诊治则具有极高的病死率。早期进行病原学诊断对SCAP的诊治及预后具有重要意义。二代测序(NGS)是近年来新兴的病原体检测方法,具有覆盖病原体广,耗时短,检测敏感等优点。本研究目的是了解中国医科大学附属第一医院成人重症社