【摘 要】
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背景及目的:突触是神经元之间信息传递的关键部位,由突触前膜、突触间隙和突触后膜组成。神经元间的信息单向流动,主要由位于突触前的突触囊泡释放神经递质介导。突触前膜被刺激发生去极化时,突触前膜的钙通道开放,Ca2+内流进入突触前,导致突触囊泡通过胞吐作用与突触前膜融合释放神经递质,随之又通过胞吞作用完成囊泡组分的回收,维持突触囊泡的可持续释放。因此,突触囊泡通过胞吐作用释放神经递质对于神经元之间的信息
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背景及目的:突触是神经元之间信息传递的关键部位,由突触前膜、突触间隙和突触后膜组成。神经元间的信息单向流动,主要由位于突触前的突触囊泡释放神经递质介导。突触前膜被刺激发生去极化时,突触前膜的钙通道开放,Ca2+内流进入突触前,导致突触囊泡通过胞吐作用与突触前膜融合释放神经递质,随之又通过胞吞作用完成囊泡组分的回收,维持突触囊泡的可持续释放。因此,突触囊泡通过胞吐作用释放神经递质对于神经元之间的信息传递至关重要。钙调蛋白（calmodulin,CaM）是几乎表达于所有真核细胞中的Ca2+结合蛋白。在哺乳动物中,CaM主要由三个不同的基因编码。研究发现,CaM在神经突触信息传递的过程中发挥重要作用,其参与突触囊泡回收的作用已被报道,然而CaM是否调节突触囊泡的释放仍存在争议。因此本课题拟设计si RNA以特异性干扰3种基因编码的CaM,进一步分析RNA干扰CaM后对于神经元突触囊泡释放的影响以及可能的调节机制。研究方法:1、原代培养小鼠海马神经元,并利用免疫荧光实验分析成熟神经元所占比例,便于后续实验研究;2、利用细胞转染、蛋白质印迹以及免疫荧光实验分析针对3种CaM基因的si RNA的干扰效率。3、将能够标记囊泡释放的质粒Synapto-p Hluorin转染至原代小鼠海马神经元,利用活细胞实时显微成像技术检测电刺激后海马神经元的突触囊泡释放情况,分析敲降CaM对突触囊泡释放的影响。4、利用透射电镜技术检测抑制CaM后的海马神经元突触前膜囊泡数量的改变。5、利用全细胞膜片钳技术,记录原代海马神经元静息电位和动作电位变化,分析敲降CaM对神经元兴奋性的影响。6、利用新生RNA测定和新生蛋白质测定的方法,检测敲降CaM后,海马神经元新生的核糖体RNA及新生蛋白质合成情况。结果:1、原代培养的小鼠海马原代神经元中,成熟神经元可达90%以上。2、将CaM的si RNA干扰序列转染至海马神经元后,能够有效敲降神经元中CaM的表达。3、利用si RNA干扰CaM的表达后,可以抑制神经元突触囊泡的释放。4、以si RNA干扰CaM的表达后,海马神经元突触囊泡的数量减少。5、利用si RNA干扰CaM的表达后,诱发海马神经元发生动作电位的阈值升高,诱发出现的动作电位的数量显著降低,说明敲降神经元中CaM后抑制了神经元的兴奋性。6、敲降CaM后,海马神经元新生成的核糖体RNA及新生蛋白质的含量显著降低。结论:1、利用si RNA能够有效敲降原代海马神经元中CaM的表达。2、敲降CaM后可以抑制海马神经元突触囊泡的释放。3、CaM可能通过两条途径来调节突触传递,一为调控神经元的兴奋性影响突触囊泡释放,二为调控蛋白质新生影响突触囊泡的生成。
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