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目的脓毒症(Sepsis)是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,大量研究表明脓毒症的发病机制及其发展过程十分复杂,在病情发展过程中常伴随脓毒性休克,危重患者常伴多器官功能障碍综合征,脓毒症已经成为目前危重病医学中的一大难题。急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)作为临床中脓毒症最常见的并发症,造成脓毒症AKI致死率极高。但是,目前尚未发现有效的能够对AKI进行早期诊断的指标。同时,脓毒症AKI的病理生理机制相当复杂,极大地限制了脓毒症AKI的早期干预治疗。近年来对脓毒症急性肾损伤深入的研究结果表明miRNA对脓毒症急性肾损伤的调控具有关键作用,且特异miR-22是脓毒症患者诊断与预后评估的无创生物学指标,但具体对脓毒症急性肾损伤患者的调控作用报道较少。因此,本研究拟建立脓毒症AKI细胞和大鼠模型,通过探讨miR-22在脓毒症急性肾损伤中的作用以及分子机制,明确miR-22在脓毒症急性肾损伤中的临床价值。方法(1)采用LPS(10μg/mL)诱导HK-2进行脓毒症AKI细胞模型的构建,利用Rittirsch等[1]介绍的方法建立CLP脓毒症AKI模型;(2)通过对假手术组、模型组、模型+Ad-miR-NC组和模型+Ad-miR-22组大鼠术后肾脏组织进行了苏木精-伊红染色法(HE)、Massion和过碘酸雪夫染色(PAS)用以评价脓毒症急性肾损伤大鼠肾组织病理学改变;石蜡切片tunnel检测细胞凋亡;(3)利用qRT-PCR检测动物和细胞模型中miR-22的表达;Western blot检测动物和细胞模型中 PTEN、HGMB1、TLR4、p65、p-p65 的表达,GAPDH 作为对照;(4)生物信息学预测miR-22的靶基因PTEN的结合靶点;利用双荧光素酶报告系统验证miR-22与PTEN的调控关系;(5)全自动生化分析仪测定血清肌酐(ScR)、尿素氮(BUN)水平;采用ELISA试剂盒测定血清中肾损伤分子1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、TNF-α、IL-1β、IL-6和NO含量。结果(1)与正常对照组相比,LPS模型组和LPS模型+Ad-miR-NC组中miR-22的表达均显著降低(p<0.05),LPS模型+Ad-miR-22组中miR-22的表达则显著提高(p<0.05);PTEN在不同组别中呈现出与miR-22的表达相反的趋势;(2)与正常对照组相比,PTEN、HMGB1、TLR4、p-p65蛋白水平在LPS模型组和LPS模型+Ad-miR-NC组中表达量显著增高(p<0.05);与LPS模型+Ad-miR-NC组相比,LPS模型+Ad-miR-22组中PTEN、HMGB1、TLR4、p-p65的蛋白表达水平则显著降低(P<0.05);同时,与正常对照组相比,细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量在LPS模型组和LPS模型+Ad-miR-NC组中表达量显著增高(p<0.05);与LPS模型+Ad-miR-NC组相比,LPS模型+Ad-miR-22组中细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量则显著降低(p<0.05);(3)通过生物信息学预测发现miR-22可以与PTEN的3’UTR 5’-GGCAGCUA-3’区结合;同时,与对照组相比,在WT-PTEN-3’UTR野生型和miR-22腺病毒共转染组中LUC荧光量值显著降低(p<0.05);但是,在PTEN-3’ UTR突变型共转染miR-22腺病毒和PTEN-3’ UTR突变型和对照组中LUC荧光量值则恢复到对照组的水平;(4)与正常对照组相比,LPS模型组及LPS模型+shCTRL组中PTEN、HMGB1、TLR4和p-p65蛋白水平显著提高(p<0.05);但是与LPS模型+shCTRL组相比,在LPS模型+shPTEN组中PTEN、HMGB1、TLR4和p-p65蛋白水平则显著降低(p<0.05);同时,与正常对照组相比,细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量在LPS模型组及LPS模型+shCTRL组中表达量显著增高(p<0.05);与LPS模型+shCTRL组相比,在LPS模型+shPTEN组中细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 含量则显著降低(p<0.05);(5)互补实验验证分析发现:与LPS模型+Ad-miR-22+pcDNA4.0组相比,在LPS模型+Ad-miR-22+pcDNA4.0-PTEN 组中 PTEN、HMGB1、TLR4 和 p-p65 蛋白水平则显著提高(p<0.05);进一步通过对不同组别中炎症因子的含量变化分析发现:与LPS模型+Ad-miR-22+pcDNA4.0 组相比,在 LPS 模型+Ad-miR-22+pcDNA4.0-PTEN 组中 TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量均显著提高(p<0.05)。(6)假手术组(Sham组)大鼠术后清醒快,反应灵敏,活动自如,双眼分泌物少,呼吸均匀;体毛比较顺滑光泽、分布均匀,可自由饮水进食、无腹泻。模型组动物术后苏醒延迟,精神萎靡,活动迟缓,反应迟钝;呼吸增快,有竖毛、寒战、进食和饮水量显著减少、嗜睡、活动减少、多伴有腹泻;(7)与假手术组相比,模型组、模型+Ad-miR-NC和模型+Ad-miR-22组血清中血肌酐(CRE)、血尿素氮(BUN)、血清肾损伤分子1(KIM-1)及中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平的浓度均显著提高(p<0.05);进一步对模型+Ad-miR-NC组和模型+Ad-miR-22组血清中CRE、UREA、KIM-1和NGAL的浓度分析发现:与模型+Ad-miR-NC组相比,模型+Ad-miR-22组血清中CRE、UREA、KIM-1和NGAL的浓度均显著降低(p<0.05);(8)与假手术组相比,模型组和模型+Ad-miR-NC组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO含量显著增高(p<0.05);与模型+Ad-miR-NC组相比,模型+Ad-miR-22组中血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、NO含量则显著降低(p<0.05)。同时,与假手术组相比,PTEN、HMGB1、TLR4和p-p65蛋白表达在模型组和模型+Ad-miR-NC组中均显著增高(p<0.05);但是,与模型+Ad-miR-NC组相比,模型+Ad-miR-22组中PTEN、HMGB1、TLR4和p-p65的蛋白表达水平则显著降低(p<0.05);(9)与假手术组相比,miR-22的表达在模型组和模型+Ad-miR-NC组中表达量显著降低(p<0.05);但是,与模型+Ad-miR-NC组相比,模型+Ad-miR-22组中miR-22表达水平则显著提高(p<0.05);PTEN的在不同组别中的表达则显示出与miR-22相反的表达趋势;(10)与假手术组相比,模型组和模型+Ad-miR-NC组中,肾脏组织中各种结构清晰度降低,肾小球有少量纤维组织增生,同时伴有炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主;肾小球肿胀比较明显,结构不清晰,增生和浸润的细胞可压迫毛细血管腔使毛细血管腔变窄、甚至闭塞。肾小囊腔明显变小狭窄,糖类合成增加;与模型+Ad-miR-NC组相比,在模型+Ad-miR-22组中肾脏组织中各种结构清晰度提高,可见肾小球组织细胞水肿减轻,炎性细胞浸润降低;肾小球纤维化发生改善,肾小囊腔的狭窄和闭塞得到改善,糖类合成减少;(11)与假手术组相比,模型组和模型+Ad-miR-NC组中细胞凋亡显著增加(p<0.05);但是,与模型组和模型+Ad-miR-NC组相比,在模型+Ad-miR-22组中的细胞凋亡显著降低(p<0.05)。以上研究表明miR-22可以有效抑制脓毒症急性肾损伤带来的细胞凋亡;结论通过对miR-22的分子调控机制探究发现miR-22可以通过介导PTEN蛋白的表达调节炎症反应进而参与对脓毒症肾损伤的调控;进一步通过构建脓毒症大鼠模型分析发现miR-22可以通过调节肾脏细胞的炎症反应、NO的释放及细胞凋亡参与对脓毒症肾损伤的调控,影响脓毒症急性肾损伤发生和进展。对miR-22在脓毒症急性肾损伤中的作用以及机制的研究为脓毒症急性肾损伤的分子机制提供理论基础,同时对miR-22在脓毒症急性肾损伤中的早期诊断及靶向治疗提供重要参考。