目的血中游离DNA定性定量分析已在肿瘤的预后判断、复发监控及个体化治疗方面发挥越来越重要的作用,但由于游离DNA中ctDNA拷贝数低,目前以PCR为基础的基因突变检测技术尚难以达到肿瘤早期诊断的目的。本研究拟改进突变敏感分子开关获得新一代技术,优化由高保真DNA聚合酶联合硫代磷酸酯修饰的引物构成的反应体系,以进一步提高突变敏感分子开关技术在游离DNA中检测基因突变的特异性,降低其检出假阳性率。研究第一部分选择四种不同保真性的高保真DNA聚合酶,分析其聚合酶酶动力学特性,评估在新一代突变敏感性分子开关技术中的使用特点。方法1查阅现有资料,挑选了现有的四种新的高保真DNA聚合酶Phusion、Q5、Phanta Uc 和 Pfu。2以热点突变位点BRAFV600E为检测对象,构建含有BRAF V600E（c 1799T＞A）基因突变野生型（WT）重组质粒和突变型（MT）重组质粒。3设计一对靶向BRAF V600E突变基因的硫代磷酸酯修饰的新一代分子开关引物（c 1799T＞A）,该引物在-23处添加一个额外错配核苷酸。4分别测试四种高保真DNA聚合酶（Phusion、Q5、Phanta Uc和Pfu）的PCR反应退火温度梯度和时间梯度,优化各个酶的最合适的PCR反应条件。5测试PCR反应体系中BRAFV600E突变型（MT）重组质粒模板浓度梯度,比较不同酶的敏感性和特异性,评估不同高保真DNA聚合酶的酶动力学特性。结果1 Phusion、Phanta Uc、Pfu高保真DNA聚合酶PCR最佳反应条件为三步法,Q5高保真DNA聚合酶PCR最佳反应条件为两步法。2 四种高保真DNA聚合酶在扩增效率和敏感性方面从高到低排序为:Phanta Uc＞Q5＞Phusion＞Pfu。聚合酶碱基识别特异性方面从高到低排序为:Q5＞Phanta Uc＞Phusion＞Pfu。结论Phanta Uc和Q5高保真DNA聚合酶更适合在新一代BRAF V600E突变型分子开关中的应用。目的对硫化磷酸修饰的分子开关引物,在5’端及3’端添加人工不配对碱基,由于其空间结构的影响,可能会在不影响检测敏感性的情况下增加检测结果的特异性。第二部分实验拟比较不同位点人工不配对碱基引物对高保真DNA聚合酶保真性的影响,优化新一代分子开关技术中的最佳添加不配对碱基位点的检测引物。方法1设计一套全系列新一代分子开关引物,原则为3’末端硫化磷酸修饰并配对突变基因位点的基础上,在5’端依次距离突变基因位点第1-23位添加人工不配对碱基和3’末端添加1-3位人工不配对碱基。2以热点突变位点BRAFV600E为检测对象,分别使用新的高保真DNA聚合酶Phanta Uc、Q5、Phusion和Pfu联合新一代分子开关引物普通PCR扩增突变质粒模板和野生质粒模板,比较不同位点错配碱基引物的区别。结果1 3’末端添加1位人工不配对碱基引物对BRAFV600E突变模板扩增的PCR产物带最明显,野生模板扩增无产物带或明显暗于突变产物带。四种高保真DNA聚合酶具有一致性。2 5’端距突变碱基第8位添加人工不配对一碱基的反向分子开关引物,在BRAF V600E突变检测体系中PCR扩增效率高于其它位点添加错配碱基引物,野生模板无产物带出现。四种酶检测的结果一致。结论经过改良的新一代分子开关引物,即在3’末端硫化磷酸修饰并配对突变基因位点的基础上,3’末端添加1位人工不配对碱基、5’端第8位添加人工不配对碱基的反向分子开关引物,其扩增BRAFV600E突变质粒的敏感性和特异性最好。目的基于提高新一代分子开关技术特异性和敏感性两因素的考虑,选择Q5和Phanta Uc高保真DNA聚合酶联合特异性引物构建的新一代分子开关技术,在实时qPCR平台评估其检测BRAFV600E突变基因的效率,并应用于甲状腺癌患者外周血游离DNA样本的突变检测中。方法1依据第一、二部分实验结果设计特异性引物:3’末端碱基硫化磷酸修饰并与突变基因碱基配对,相邻上游添加1个人工不配对碱基和5’端添加第8位人工不配对碱基。2共收集21例甲状腺癌患者外周血提取游离DNA,收集肿瘤组织蜡块标本及临床资料,对照组健康人外周血样本提取基因组DNA。3分别使用Phanta UC高保真DNA聚合酶和Q5高保真DNA聚合酶联合新一代BRAFV600E突变敏感性分子开关引物构成的新一代BRAFV600E突变型分子开关在实时qPCR平台检测BRAFV600E突变质粒、野生质粒、突变野生混合质粒、基因组DNA混合的突变质粒。4使用新一代分子开关技术检测甲状腺癌患者外周血游离DNA中的BRAF V600E突变基因,并以肿瘤组织蜡块标本提取基因组DNA测序验证。5使用原分子开关技术检测甲状腺癌患者外周血游离DNA中的BRAFV600E突变基因,与新一代分子开关检测结果比较。结果1 Q5高保真DNA聚合酶介导的新一代BRAFV600E突变型分子开关检测BRAF V600E突变型质粒模板,其qPCR标准曲线线性关系较好（R2=0.933）,扩增效率尚可（E=177.2%）。2 Phanta Uc高保真DNA聚合酶介导的新一代BRAFV600E突变型分子开关检测BRAF V600E突变型质粒模板,其qPCR标准曲线线性关系较可（R2=0.981）,扩增效率较好（E=146.5%）。3 Q5高保真DNA聚合酶和Phanta Uc高保真DNA聚合酶介导的新一代BRAF V600E突变型分子开关在BRAFV600E野生型质粒扩增中均不易产生假阳性结果,特异性高。4 Q5高保真DNA聚合酶和Phanta Uc高保真DNA聚合酶介导的新一代BRAF V600E突变型分子开关检测BRAF野生型质粒与BRAFV600E突变型质粒（野生105 copies/μL+突变104-10copies/μL）混合模板,最低可检测到突变模板（102 copies/μL）混合野生模板（105 copies/μL）中的BRAFV600E型突变。产物经一代测序,碱基序列均符合BRAFV600E突变序列,新一代分子开关技术具有较好的模板依赖性。5 Q5高保真DNA聚合酶和Phanta Uc高保真DNA聚合酶介导的新一代BRAF V600E突变型分子开关检测基因组DNA混合BRAFV600E突变型质粒与BRAF野生型质粒中,扩增效率可,特异性高。6新一代BRAF V600E突变型分子开关检测21例甲状腺癌的外周血游离DNA标本,有1例（17号）检测出BRAFV600E型突变。对其对应的17号甲状腺癌组织样本进行测序验证,确定为存在BRAF基因15外显子V600E型突变,且显示为野生序列和突变序列共存的杂合型。该患者年龄27岁,肿瘤病灶大小2cm,有中央区淋巴结转移。7采用未优化的原分子开关技术检测21例甲状腺癌的外周血游离DNA标本,有2例（17号和21号）标本检测出BRAFV600E型突变。对21号的甲状腺癌组织样本进行测序验证,确定为BRAF基因野生型。8对21例游离DNA样本患者相对应的甲状腺癌组织样本均采用原有分子开关、新一代分子开关和一代测序比对验证,三种方法均发现有2例组织样本（15号和17号）存在BRAF基因15外显子V600E型突变,且显示为野生序列和突变序列共存的杂合型。15号患者年龄49岁,肿瘤直径0.6cm,淋巴结阴性。结论在实时qPCR平台,新一代分子开关技术是识别BRAF V600E点突变的敏感性和特异性较好的技术,可在野生模板混合突变模板中检测BRAFV600E型突变,产物为模板依赖性,可在基因组DNA混合突变质粒的模拟血浆游离DNA样品中检测到BRAFV600E型基因突变,可在甲状腺癌的外周血游离DNA标本中检测BRAFV600E型基因突变,且与肿瘤组织测序结果一致。与原分子开关技术比较,新一代突变敏感型分子开关技术特异性更高,不易产生假阳性结果。