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第一部分神经病理性疼痛对认知功能的影响及其神经炎症机制研究目的神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NPP）常伴随着不同程度的认知功能障碍,目前对其深层次的发生机制尚未明确。本研究通过建立大鼠坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constrictive injury,CCI）制作大鼠NPP模型,从调节海马神经元发生的中枢炎症的角度,综合采用行为学、分子生物学、形态学方法,探究神经病理性疼痛对认知功能的影响机制。方法选取成年雄性SD大鼠60只,随机分为3组（n=20）:对照组（CONTROL组）,假手术组（SHAM组）及NPP模型组（CCI组）。CCI组进行坐骨神经结扎,SHAM组仅暴露游离坐骨神经不结扎,CONTROL不作手术处理。分别于造模前一天测定机械痛及热痛阈值作为基础阈值,术后3天、7天、10天、14天测定机械痛及热痛阈值,术后15-19天完成Morris水迷宫测试并将所有大鼠处死,充分灌注后取海马区标本。通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法测定大鼠海马中的炎症因子,包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）;免疫印迹试验（Western blotting,WB）测定大鼠海马中的小胶质细胞标记物离子钙结合衔接蛋白1（Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1）、星形胶质细胞标记物神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic Protein,GFAP）及神经干细胞标记物Nestin的表达水平;采用免疫荧光检测大鼠海马区中Iba1、GFAP、成熟神经元标记物NeuN及反应细胞凋亡的Caspase-8的表达情况,并使用电镜观察海马区的形态学变化。结果1.与CONTROL组相比,CCI组大鼠从造模后第3天开始,即术后第3、7、10、14天机械痛阈值均显著下降（P＜0.01）,持续至实验结束,同样热痛阈值也显著下降（P＜0.01）,假手术组无统计学差异（P＞0.05）;各组大鼠对照侧肢体机械痛与热痛行为无明显变化,表明造模成功。2.在Morris水迷宫实验中,各组大鼠平均游泳速度差异无统计学意义（P＞0.05）。在定位航行实验中,第1天,各组大鼠的逃避潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05）;第2天,与CONTROL组大鼠相比,CCI大鼠的平均逃避潜伏期虽然有延长趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;第3、7、10、14天,与CONTROL组大鼠相比,CCI大鼠的平均逃避潜伏期均显著延长（P＜0.001）,在目标象限停留时间显著缩短（P＜0.05）,60 s内穿台次数显著减少（P＜0.001）,表明CCI大鼠的空间记忆能力受损严重。SHAM组大鼠以上各项指标均无统计学差异（P＞0.05）。3.与CONTROL组相比,CCI组TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平均显著增加,差异有统计学意义（两个指标均为P＜0.001）;SHAM组TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平均同样显著增加,差异有统计学意义（两个指标均为P＜0.05）。4.Western blot检测结果显示:与CONTROL组相比,SHAM组大鼠海马区Iba-1、GFAP蛋白表达水平无明显差异（两个指标均为P＞0.05）,CCI组大鼠海马区Iba-1、GFAP蛋白表达明显升高（两个指标均为P＜0.01）。电镜下CCI组大鼠海马齿状回（dentate gyrus,DG）区小胶质细胞与星形胶质细胞呈活化状态。5.Western blot检测结果显示:与CONTROL组相比,SHAM组大鼠海马区Nestin蛋白表达水平无明显差异（P＞0.05）,CCI大鼠海马区Nestin蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。6.免疫荧光检测三组大鼠海马DG区NeuN、Caspase-8的表达。结果显示:CONTROL组与SHAM组大鼠海马区NeuN与Caspase-8标记阳性的细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）;而与SHAM组相比,CCI组大鼠海马区NeuN标记阳性的细胞数量明显增减少（P＜0.001）,Caspase-8标记阳性的细胞数量明显增加（P＜0.001）。结论在大鼠CCI模型中,神经病理性疼痛能导致大鼠学习能力以及空间记忆的缺陷,其机制可能为疼痛导致的大鼠海马区小胶质细胞和星形胶质细胞的激活及大量炎性因子（IL-1β和TNF-α）释放,继而损伤成熟神经元和新生神经元的发生从而影响其认知功能。第二部分英夫利西单抗对神经病理性疼痛介导认知功能障碍的影响及其机制的研究目的英夫利西单抗（Infliximab,IFX）作为TNF-α单克隆抗体广泛应用于各类疾病,其具有抗炎、抗氧化应激及抗凋亡的作用。本研究通过侧脑室给予IFX的方式观察IFX对CCI大鼠中枢炎症反应、成熟神经元凋亡以及神经干细胞的发生等方面的影响从而探究IFX治疗神经病理性疼痛介导认知功能障碍中的机制。方法选取80只成年雄性SD大鼠随机分为4组（n=20）:假手术组（SHAM）,假手术组+英夫利西单抗组（SHAM+IFX）,NPP模型组（CCI）,NPP模型+英夫利西单抗组（CCI+IFX）。CCI组进行坐骨神经结扎,SHAM组仅暴露游离坐骨神经不结扎;术后第1、5、9天,SHAM+IFX组、CCI+IFX组每日双侧侧脑室给药1次,IFX的单侧给药体积为10 μl,浓度为10 mg/ml;分别于造模前一天测定机械痛及热痛阈值作为基础阈值,术后3天、7天、10天、14天测完机械痛及热痛阈值,术后15-19天完成Morris水迷宫测试并将所有大鼠处死。灌注完全后取海马区标本。通过ELISA法测定大鼠海马炎症因子TNF-α、IL-1β。Western Blot方法测定大鼠海马区Iba1,GFAP,Nestin蛋白表达水平。采用免疫荧光染色进行大鼠海马区Iba1、GFAP,成熟神经元标记物NeuN未成熟神经元细胞标记物DCX以及反应细胞凋亡的Caspase-8多重标记并电镜下观察其形态学变化。结果1.与SHAM组相比,CCI+IFX组大鼠在造模后第3天术侧足底即出现机械痛阈值的下降,差异有统计学意义,在术后第7天机械痛阈值与热痛阈值均达到最低水平,并持续到实验结束（术后3、7、10、14四组数据两个指标比较均为P＜0.01）SHAM+IFX组机械痛阈值与热痛阈值无统计学差异（P＞0.05）。与CCI组相比,CCI+IFX组大鼠在大鼠第3、7、10、14天术侧足底机械痛阈值与热痛阈值均升高,差异有统计学意义（四组数据两个指标比较均为P＜0.01）;2.在Morris水迷宫实验中,各组大鼠平均游泳速度差异无统计学意义（P＞0.05）。在定位航行实验中,SHAM组与SHAM+IFX组各个时间点平均逃逸潜伏期时长的差异均无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM组相比,CCI组和CCI+IFX组在定位航行实验第1天、第2天,各组大鼠的逃避潜伏期均无统计学差异（P＞0.05）;在训练的第3天出现CCI组和CCI+IFX组平均逃逸潜伏期均延长,差异有统计学意义（P＜0.01）;训练第4天CCI组平均逃逸潜伏期依旧延长,差异有统计学意义（P＜0.05）,而CCI+IFX组差异无统计学意义（P＞0.05）。空间探索实验结果显示:比较SHAM组与SHAM+IFX组目标象限停留时间比、60s穿台次数,差异无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM组相比较,CCI组目标象限停留时间比与60s内穿台次数均减少,差异有统计学意义（P＜0.01）,CCI+IFX组目标象限停留时间比差异无统计学意义（P＞0.05）,60s内穿台次数减少,差异有统计学意义（P＜0.01）与CCI组相比较,CCI+IFX组在目标象限停留时间比显著性增加,差异有统计学意义（P＜0.01）,60s内穿台次数显著增加,差异有统计学意义（P＜0.01）。3.ELISA结果显示:比较SHAM组与SHAM+IFX组TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,差异无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM组相比,CCI组与CCI+IFX组的TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均显著性升高,差异有统计学意义（P＜0.01）。与CCI组相比较,CCI+IFX组TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均显著性降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。4.Western blot检测结果显示:比较SHAM组与SHAM+IFX组Iba-1、GFAP蛋白表达水平,差异无统计学意义（P＞0.05）。与SHAM组相比,CCI组与CCI+IFX组Iba-1、GFAP蛋白表达水平均显著性升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与CCI组相比,CCI+IFX组Iba-1、GFAP蛋白表达水平均显著性降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。免疫荧光结果显示:CCI组、CCI+IFX组大鼠海马DG区小胶质细胞、星形胶质细胞均呈活化状态,而与CCI组相比较,CCI+IFX组的小胶质细胞、星形胶质细胞的数量明显降低,而且其细胞体积缩小,分支回缩增加,形态学结果表明经IFX治疗后的海马区小胶质细胞、星形胶质细胞均呈低活化状态。5.Western blot检测结果显示:与SHAM组相比,CCI组大鼠海马区Nestin蛋白表达水平呈显著性降低（P＜0.01）,CCI+IFX组大鼠海马区Nestin蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;与CCI组相比,CCI+IFX组Nestin蛋白表达水平呈显著性升高（P＜0.01）。免疫荧光检测结果显示DCX阳性细胞主要分布于海马齿状回颗粒下区（subgranular zone,SGZ）,与SHAM组相比,CCI组DCX表达阳性细胞明显数量减少（P＜0.001）,而经过治疗的CCI+IFX组DCX阳性细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）;与CCI组相比,CCI+IFX组DCX阳性细胞数量显著升高,差异有统计学意义（P＜0.001）6.免疫荧光检测四组大鼠海马DG区NeuN、Caspase-8的表达,结果显示:与SHAM组相比,CCI组大鼠海马DG区NeuN阳性细胞数量显著减少（P＜0.01）,Caspase-8阳性细胞数量显著增多（P＜0.01）,CCI+IFX组大鼠海马DG区NeuN、Caspase-8阳性细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）;与CCI组相比,CCI+IFX组NeuN阳性细胞数量显著增多（P＜0.001）,Caspase-8阳性细胞数量显著减少,差异有统计学意义（P＜0.001）。结论英夫利西单抗可以治疗NPP大鼠的认知功能障碍,并取得良好的疗效,其机制可能是英夫利西单抗通过抗炎抗氧化应激减少了中枢炎症反应对大鼠海马DG区成熟神经元、神经细胞发生的影响。