【摘 要】
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背景在脑缺血再灌注损伤后,被活化的小胶质细胞可极化为不同的表型（促进炎症反应的M1型或抵抗炎症反应的M2型）,以调节神经组织的炎症反应过程。Sirt1作为脱乙酰基酶家族的一员,在调节小胶质细胞/巨噬细胞极化和自噬中起重要作用。DJ-1是一个多功能蛋白,在细胞凋亡、转录等方面起重要作用。我们前期的研究表明,DJ-1对脑缺血再灌注损伤具有抗炎症损伤的作用。DJ-1的神经保护作用是否与影响小胶质细胞极化
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背景在脑缺血再灌注损伤后,被活化的小胶质细胞可极化为不同的表型（促进炎症反应的M1型或抵抗炎症反应的M2型）,以调节神经组织的炎症反应过程。Sirt1作为脱乙酰基酶家族的一员,在调节小胶质细胞/巨噬细胞极化和自噬中起重要作用。DJ-1是一个多功能蛋白,在细胞凋亡、转录等方面起重要作用。我们前期的研究表明,DJ-1对脑缺血再灌注损伤具有抗炎症损伤的作用。DJ-1的神经保护作用是否与影响小胶质细胞极化有关,尚不清楚。目的研究在大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）/再灌注（Reperfusion）模型中,DJ-1影响小胶质细胞极化及具体的分子机制。方法（1）我们采用MCAO/R模型模拟缺血再灌（ischemia/reperfusion,I/R）损伤,大脑中动脉闭塞1h,再灌注12h、24h、48h,用Western blot检测上述三个再灌注时间点小胶质细胞标记物（CD86、Arg1、IL-10）的表达。（2）建立MCAO/R模型,于建立MCAO/R模型24h前注射DJ-1si RNA,干扰DJ-1的表达,注射位点大鼠侧脑室。观察DJ-1干扰在脑I/R损伤后对神经功能、脑梗死体积、小胶质细胞形态的影响。用Western blot检测DJ-1干扰对小胶质细胞极化的影响。在干扰DJ-1的同时给予ND-13（一种基于DJ-1氨基酸序列合成的多肽）治疗,观察对大鼠神经功能、脑梗死体积、小胶质细胞极化的影响。（3）建立MCAO/R模型,于建立MCAO/R模型24h前注射DJ-1si RNA,注射位点大鼠侧脑室。并于模型建立后大鼠苏醒时,腹腔注射Sirt1的特异性抑制剂EX-527。首先利用免疫共沉淀（Co-IP）检测DJ-1与Sirt1相互作用的关系。Western blot检测在DJ-1干扰的同时抑制Sirt1对小胶质细胞极化的影响。其次,通过Western blot检测Beclin1、LC3II/LC3I、p62的表达,透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察自噬体超微结构。最后,用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）、Western blot检测自噬相关复合体各蛋白（Atg5、Atg12、Atg16L1）的表达,Co-IP检测Atg5-Atg12-Atg16L1三者的相互作用。结果（1）再灌注48h后,M1型小胶质细胞标记物CD86的表达达到高峰。M2型小胶质细胞标记物（Arg1、IL-10）的表达于再灌注24h达到高峰。（2）与MCAO/R组相比,DJ-1干扰大鼠的神经功能受损明显,脑梗死体积明显增加,Iba1阳性小胶质细胞数量未发生明显变化,但形态却改变了,M1型细胞因子（CD86、IL-6）的表达升高,M2型细胞因子（Arg1、IL-10）的表达降低。ND-13可逆转DJ-1干扰对神经功能的损伤、脑梗死体积增加和小胶质细胞极化的影响。（3）在MCAO/R模型中,DJ-1与Sirt1相互结合。DJ-1干扰后,Beclin1、LC3II/LC3I、p62、Atg5、Atg12、Atg16L1的表达降低,TEM下自噬体的数量减少。与DJ-1si RNA组相比,在DJ-1干扰的同时抑制Sirt1,CD86、IL-6的表达进一步升高,Arg1、IL-10的表达降低更明显。Beclin1、LC3II/LC3I、p62、Atg5、Atg12、Atg16L1的表达进一步降低,TEM观察到的自噬体数量极少。结论DJ-1可能是通过影响小胶质细胞极化减轻脑I/R炎症损伤。而DJ-1影响小胶质细胞极化的机制可能是DJ-1通过Sirt1激活自噬相关复合体Atg5-Atg12-Atg16L1来促进自噬过程,从而调节脑I/R损伤期间的小胶质细胞极化。DJ-1可能是治疗脑I/R损伤的药物靶点。
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