【摘 要】
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水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是一类广泛存在于原核及真核生物细胞膜上的跨膜通道蛋白,具有完整的质膜,能够转运水分子及一些溶质小分子物质。AQPs最初在红细胞质膜上鉴定出来,细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）基因组测序发现细粒棘球绦虫体内存在12个编码AQPs的基因。为研究细粒棘球蚴AQPs（EgAQPs）是否对棘球蚴囊液形成具有调控功能,本课题组前期
【基金项目】
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国家自然科学基金课题，叶彬主持（基金号:81672045）；
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水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）是一类广泛存在于原核及真核生物细胞膜上的跨膜通道蛋白,具有完整的质膜,能够转运水分子及一些溶质小分子物质。AQPs最初在红细胞质膜上鉴定出来,细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）基因组测序发现细粒棘球绦虫体内存在12个编码AQPs的基因。为研究细粒棘球蚴AQPs（EgAQPs）是否对棘球蚴囊液形成具有调控功能,本课题组前期研究了其中6个EgAQPs基因在非洲爪蟾（Xenopus laevis,X.laevis）卵母细胞中的透水功能,未发现这6个基因具有透水功能。因此,本试验继续研究余下6个EgAQPs基因是否能够调控棘球蚴囊液的进出。1.收集体外培养不同时期的棘球蚴标本和接种在BALB/c小鼠体内的继发棘球蚴标本,RT-qPCR方法检测6个EgAQPs基因在体内、体外培养不同发育时期的转录表达水平,结果无论体内还是体外培养,6个EgAQPs基因表达量均很低,几乎没有表达。2.根据NCBI数据库中EgAQPs基因编码区序列设计EgAQP3、EgAQP4-1、EgAQP4-4和EgAQP9-1基因的全长引物,以细粒棘球蚴c DNA为模板,PCR扩增EgAQP3、EgAQP4-1、EgAQP4-4和EgAQP9-1基因;应用化学合成方法合成EgAQP4-2、EgAQP 4-5基因,在非洲爪蟾卵母细胞中表达这6种EgAQPs,验证其水通道功能。结果成功克隆6个EgAQPs基因,重组质粒pCS107-EgAQPs经测序无突变。注射EgAQPs基因的非洲爪蟾卵母细胞体积变化率和透水系数与阴性对照组相比差别无统计学意义（p>0.05）,这6个EgAQPs基因在卵母细胞中未表现出透水功能。Western blot检测6个EgAQPs基因在卵母细胞总蛋白、胞质蛋白与胞膜蛋白上的表达,结果均未观察到EgAQPs在预期的水通道蛋白理论分子量处表达。3.密码子优化生物信息学分析结果显示酵母表达系统可能比非洲爪蟾卵母细胞表达系统更适合EgAQPs基因的外源表达,根据细粒棘球绦虫原头蚴水通道蛋白编码基因的转录组分析,EgAQP9-1的表达量最高,这个分析结果与qPCR实验结果相吻合,因此我们选用EgAQP9-1基因来验证。以pPIC9K质粒作为载体,构建真核表达重组质粒pPIC9K-EgAQP9-1,电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞,1%甲醇诱导蛋白表达,Western Blot检测蛋白表达情况。结果:成功构建重组质粒pPIC9K-EgAQP9-1,电转入毕赤酵母GS115感受态细胞成功,甲醇诱导表达后,Western Blot检测到EgAQP9在理论分子量37 kD左右有一条明显的条带,但是在17 kD与20 kD左右的地方也出现两条明显的条带,可能在EgAQP9-1蛋白合成过程中不能正确的剪切、折叠或化学修饰所致,也可能是与抗体反应后出现的非特异性条带。在原头蚴囊化形成继发棘球蚴过程中EgAQPs基因转录水平很低,这些基因在非洲爪蟾卵母细胞中均未表现出透水功能。选择转录表达量最高的EgAQP9-1基因在毕赤酵母细胞中的表达,检测到条带出现在等于和小于理论分子量处。总之,在棘球蚴囊壁上存在着AQPs基因,在原头蚴囊化形成棘球蚴过程中基因可能逐渐处于沉默或低表达状态,恰好阻止了棘球蚴囊液流出,致使棘球蚴囊液逐渐积累。
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