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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性、常见的特发性自身免疫性的疾病,且有着明显的性别倾向,女性跟男性相比,发病率大概在3:1。RA的特征性表现在于炎症性关节炎和滑膜炎,边缘骨侵蚀,关节软骨退化以及免疫反应的全身表现。尽管RA是一种主要以关节炎症为特征的疾病,但研究表明,有50%的RA患者患有关节外累及的表现,其中,肺间质病变（interstitial lung disease,ILD）是RA患者常见的,且明显降低患者预后和生活质量、增加死亡率的关节外并发症。由于调查人群、诊断标准和检测方法等不同（高分辨率CT、胸部平片、肺功能检查等）,近十年来各种报道中类风湿关节炎合并肺间质病变（rheumatoid arthritis associated intersitial lung disease,RA-ILD）的发病率存在很大差异,范围可达3%-67%。在RA-ILD的早期,仅约10%的患者可能表现出ILD相关症状,大多数RA-ILD患者早期无明显的临床表现,当诊断RA-ILD后5年死亡率为35%-39%。因此,早期发现并干预RA-ILD至关重要。在人类基因组中,90%以上基因是有效转录的,但其中只有1%-2%的基因编码蛋白质。人类基因组中其余大部分不具有编码蛋白质潜能的基因,被称为非编码RNA（noncoding RNA,ncRNA）。基于调控ncRNA的转录本长度将其分为含有超过200个核苷酸的长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）,和小于200个核苷酸的短链非编码RNA（short noncoding RNA,sncRNA）。越来越多的研究表明,lncRNA分别在转录后、转录和染色体水平的基因调控中起到许多至关重要的生物学功能,且参与自身免疫性疾病（如RA）和ILD的发生发展。虽目前尚无关于RA-ILD和lncRNA的相关研究,但考虑到lncRNA在RA及ILD发病机制中的重要地位,本研究试图对RA-ILD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中差异表达的lncRNA进行鉴定分析。第一部分 RA-ILD患者的表达谱特征化IncRNA-mRNA之间的功能调节为排除已知RA-ILD危险因素（吸烟、男性、老龄等）的影响,本研究设定研究对象均为无吸烟史及结核、心血管疾病等病史的中年女性,通过lncRNA芯片（同时测定lncRNA和mRNA）分析比较了中年女性RA-ILD患者较RA患者及健康对照者（healthy control,HC）PBMC中lncRNA及mRNA的差异表达,并分析致病基因的染色体富集,lncRNA对邻近基因的影响。进行Pearson相关性测试以鉴定lncRNA-mRNA关联。构建了 lncRNA-mRNA共表达网络以推断RA-ILD生物学通路中的调节机制。进行KEGG通路和GO分析,以探讨差异表达基因在RA-ILD中的潜在作用。综上分析RA-ILD中差异表达lncRNA的潜在功能,并为下一步筛选部分RA-ILD的候选标记基因进行验证做准备。在RA-ILD组与RA组对比中,我们获得了 5471个显著差异表达的mRNA（3115个上调,2356个下调）和5250个显著差异表达的lncRNA（2965个上调,2285个下调）,在5250个差异表达的lncRNA中,有1677个与lncRNA相邻（300kb内）的mRNA也存在差异表达,与相邻的mRNA（100 kb内）有关联的差异表达的lncRNA-mRNA对共3178对。在RA-ILD组与HC组对比中,我们获得了 1728个差异表达的mRNA（733个上调,995个下调）和1833个差异表达的lncRNA（1018个上调,815个下调）,在1833个差异表达的lncRNA中,有291个与lncRNA相邻（300kb内）的mRNA也存在差异表达,与相邻的mRNA（100 kb内）有关联的差异表达的lncRNA-mRNA对共413对。差异表达的mRNA和lncRNA并没有显著富集在某条染色体上。GO富集分析提示,RA-ILD组较RA组相比,上调的基因主要是参与细胞的代谢过程,下调基因主要参与免疫系统通路。RA-ILD组较HC组相比,上调的基因主要涉及中性粒细胞介导的免疫调控和骨髓白细胞介导的免疫调控,下调基因主要涉及T细胞活化和T细胞受体信号传导通路。KEGG通路分析提示,RA-ILD组较RA组相比,上调基因主要参与了 NOD样受体信号通路和泛素介导的蛋白水解过程,下调的基因主要参与了原发性免疫缺陷和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。RA-ILD组较HC组相比,上调基因主要参与了白细胞介素（interleukin,IL）-17 信号通路和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）信号通路,下调基因主要参与了胆固醇代谢和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。分别对RA-ILD组与RA组及HC组比较所得的差异表达mRNA和lncRNA进行相关性分析,选择P<0.05且相关系数>0.9的lncRNA-mRNA对为共表达关系对,并分别构建lncRNA-mRNA共表达网络。按lncRNA在两个网络中节点度的变化程度,筛选节点度变化度最大的前1%的lncRNA为功能扰动lncRNA。最终,总共获得了 15个在两种网络状态下功能发生扰动的lncRNA,即:TCONS1200030586,ENST00000551075,NR046241,ENST00000607625,TCONS1200006925,T206892,ENST00000602954,NR—029401,ENST00000609151,uc00lvrz.l,T112526,ENST00000507808,uc003qrv.1,T344288,ENST00000515150。对这15个lncRNA在两个共表达网络中共表达的mRNA取并集,并分别进行GO富集分析,发现其参与的生物学功能主要集中在:异戊烯基转移酶活性、烷基或芳基（甲基除外）基团的转移、核糖体结合、硫醇依赖性的性泛素特异性蛋白酶活性四个方面。基于微阵列数据,分析lncRNA和mRNA的差异表达水平、致病基因的染色体富集、lncRNA对邻近基因的影响、GO分析、KEGG通路分析以及构建lncRNA-mRNA共表达网络,本研究获得了以上结果,这对下一步挑选验证RA-ILD相关的差异表达lncRNA及进一步研究相关机制提供了一定的思路。第二部分 RA-ILD患者PBMC中差异表达lncRNA的鉴定及与临床指标的相关性分析根据芯片检测出的lncRNA在RA-ILD组与RA组及HC组差异表达趋势的一致性、差异表达的fold-change程度、lncRNA的种类以及是否已被证实与RA 或 ILD 相关,我们共挑选出 6 个候选 lncRNA（ENST00000429666、uc.471-、NR038935、ENST00000560199、ENST00000603415 和 NR002819）进行 PCR验证。因在前期的小样本（8例）验证中,ENST00000429666、uc.471-在三组间并为表现出明显的统计学差异,故我们只对NR038935、ENST00000560199、ENST00000603415和NR002819进行了后期的大样本（32例）验证。因考虑男性为RA-ILD的危险因素,且RA-ILD根据影像学表现又可分型为UIP（19例,其中女性13例,男性6例）和NSIP（13例,其中女性7例,男性6例）,故本研究对RA-ILD组、RA组、HC组根据以上因素进行了不同的分组比较,包括三组间总体lncRNA的比较、三组间女性（各20例）lncRNA的比较,三组间男性（各12例）lncRNA的比较,RA-ILD组间男女lncRNA的比较,不同RA-ILD影像学分型下lncRNA的比较。PCR验证结果表明,不论在总体比较下,还是根据性别、RA-ILD不同影像学分型分组比较,NR002819（MALAT1）、NR038935 和 ENST00000603415均在RA-ILD组中较RA组和HC组中表达明显升高,而ENST00000560199在RA-ILD组中较RA组和HC组中表达明显降低。除ENST00000603415外,其余3个lncRNA在男性中的差异表达程度均高于女性。4个lncRNA在不同RA-ILD影像学分型亚组间比较无显著统计学差异。在分析4个lncRNA在各组间不同表达后,为进一步判断差异表达的lncRNA是否对RA-ILD有一定诊断意义,我们又进一步计算了 NR002819、NR038935、ENST00000603415 和 ENST00000560199 的 ROC 曲线及 AUC,结果示当以存在ILD为状态变量时,NR002819、NR038935和ENST00000603415的AUC分别为0.889（诊断准确度为中度）、0.787（诊断准确度为中度）和0.962（诊断准确度为高度）,当以不存在ILD为状态变量时,ENST00000560199的AUC数值为0.863（诊断准确度为中度）。通过计算得出,NR002819、NR038935、ENST00000603415 和 ENST00000560199的最佳截断点分别为3.576（灵敏度=0.844,特异度=0.937）、1.516（灵敏度=0.469,特异度=0.984）、1.847（灵敏度=0.813,特异度=0.969）和 0.481（灵敏度=0.781,特异度=0.844）。为进一步分析差异表达lncRNA在RA-ILD中可能发挥的作用与地位,我们测定了 RA-ILD组患者中,目前已知研究较多的RA-ILD相关的生物标志物（KL-6）、临床相关指标[血沉（erythrocyte sedimentation rate,ESR）、C 反应蛋白（C-reaction protein,CRP）、类风湿因子（rheumatoid factor,RF）、抗环瓜氨酸化肽（cyclic citrullinated peptid,CCP）抗体、用力肺活量预测百分比（FVC%）、第一秒用力呼气容积预测百分比（FEV1%）和一氧化碳弥散量预测百分比（DLCO%）]以及结合第一部分GO分析及KEGG分析提示的差异表达基因可能通过IL-17及TNF-α通路发挥作用而挑选的目前被广泛证实的与RA或ILD相关的生物标志物（IL-17A、TNF-α、IL-6、IFN-γ）。将以上测定的指标与4个差异表达的lncRNA进行了相关性分析。相关性分析结果表明,NR002819与KL-6呈正相关,与FVC%、FEV1%、DLCO%呈负相关,与 TNF-α呈负相关,与 IL-6、IFN-γ、IL-17A、RF、CCP、ESR、CRP无明显相关性。NR038935与KL-6呈正相关,与FVC%、FEV1%、DLCO%呈负相关,与 IL-6、TNF-α、IFN-y、IL-17A、RF、CCP、ESR、CRP均无明显相关性。ENST00000560199与KL-6呈负相关,与FEV1%和DLCO%呈正相关,与FVC%无明显相关性,与IL-6、TNF-α、IFN-y、IL-17A、RF、CCP、ESR、CRP均无明显相关性。ENST00000603415与KL-6无明显相关性,与FVC%呈负相关,与FEV1%及DLCO%无明显相关性,与IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、RF、CCP、ESR、CRP 均无明显相关性。结合以上结果及已有的文献报道和基因库搜索分析,本研究结果表明,lncRNANR002819、NR038935、ENST00000603415 和 ENST00000560199 的差异表达可能与RA-ILD的严重程度有一定相关性,且可能对RA-ILD的诊断起到一定作用,但仍需大样本前瞻性实验及相关机制研究进一步明确。