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帕金森病(Parkinson disease,PD)是目前世界上常见的慢性神经系统退行性病变,发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),且随年龄增长发病率锐增。90%以上的病人发病年龄大于55岁,国外报道65岁以上人群患病率大约1%,而85以上人群患病率上升至4%。PD的神经病理特征表现为残存神经元胞浆内路易小体(lewy bodies, LB)和黑质纹状体致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性缺失。虽然到目前为止,PD的病因仍不清楚,但多数学者支持该病是遗传和环境因素共同作用的结果。线粒体是动态的细胞器,研究结果显示无论是散发还是遗传的PD,线粒体异常都参与了该疾病的发生。DJ-1(PARK7)是一种多功能蛋白,可以通过多种途径减少氧化应激造成的细胞损伤。DJ-1本身可作为一个抗氧化剂,通过自身半胱氨酸的氧化,参与细胞内多余活性氧(reactive oxygen species,ROS)的清除。另外,DJ-1能转录调控谷胱甘肽的合成,增强细胞的抗氧化能力。其1-5外显子长片段缺失或L166P点突变均可导致常染色体隐性PD发生,并且在散发的PD病人中也发现DJ-1的突变存在。DJ-1蛋白166位发生突变导致该蛋白不能形成有活性二聚体,因而细胞不能清除外源加入的过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2),连内源性产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)也不行。DJ-1敲除及其病理性突变导致细胞对氧化应激的敏感性提高。敲除DJ-1基因的动物模型对氧化应激的敏感性增加,从而导致多巴胺能神经元细胞的死亡。Parkin(PARK2)基因的突变与常染色体隐性青少年PD相关(autosomal recessive juvenile Parkinsonism,AR-JP)。该基因编码的蛋白具有泛素E3连接酶活性。Parkin除了通过泛素蛋白酶体系统参与底物降解,还在信号传导、DNA修复、氧化应激和线粒体稳态等多方面发挥重要作用。DJ-1和Parkin都是常染色体隐性家族型PD的致病基因,且都参与调控线粒体稳态,然而它们具体的作用机制以及是否具有相互作用仍不清楚。本研究主要在SH-SY5Y神经细胞中研究DJ-1和Parkin对线粒体稳态的调节作用,以及Parkin对DJ-1突变和下调表达细胞的线粒体的保护作用。主要的方法和结果如下：1.外源加入H2O2构建SH-SY5Y的氧化应激模型,并检测线粒体功能。实验结果显示,加入外源H2O2后,细胞中的ROS水平增加、线粒体的膜电势和细胞内ATP含量下降、线粒体片段增加。并发现在加入H2O23h后,DJ-1蛋白表达有明显增加的趋势,随后表达降低。2.DJ-1下调表达SH-SY5Y细胞模型的建立及检测。设计合成DJ-1的siRNA干扰序列,测序鉴定后转染SH-SY5Y细胞,通过realtime PCR、Western blot和免疫荧光在mRNA和蛋白两个水平检测DJ-1下调效率。细胞凋亡检测显示,与对照组相比,DJ-1下调组凋亡细胞增多,并且对H202敏感性增加。此外,同外源加入H202相似,下调内源DJ-1蛋白表达,同样可以提高细胞中ROS水平、降低线粒体的膜电势下降、阻断ATP合成、促进Cyto C释放到细胞质中。3.建立及检测过表达病理性DJ-1L166P突变蛋白的SH-SY5Y细胞模型。经测序证实的L166P质粒转染SH-SY5Y细胞。免疫荧光技术检测转染效率。细胞凋亡和线粒体功能检测结果显示,DJ-1L166P突变蛋白的表达促进细胞凋亡、增加细胞中ROS水平、降低线粒体的膜电势和ATP含量。外源H202处理提高DJ-1L166P突变细胞的氧化应激水平。4.在氧化应激状态下Parkin对细胞线粒体功能的调节作用。免疫荧光技术检钡Parkin主要在细胞质中分布,少部分与线粒体共定位。Western blot和免疫组化结果显示,在加入H2023h时,Parkin蛋白表达增加,这与DJ-1相同。在过表达Parkin的细胞中加入外源H202后,ROS水平增加, ATP合成没有明显改变。5.免疫共沉淀结果显示,在SH-SY5Y细胞中Parkin和DJ-1可以直接结合,过氧化氢处理减弱这种结合重用。与DJ-1WT组相比,L166P突变蛋白与Parkin的结合降低。免疫荧光结果显示,DJ-1敲除而非L166P突变细胞中,Parkin蛋白的表达降低。6.过表达Parkin挽救下调DJ-1引起的线粒体稳态失衡。实验结果表明,过表达Parkin可以通过改善DJ-1下调细胞中线粒体的功能缺陷(细胞内ROS增加、线粒体的膜电势降低、ATP含量减少)和线粒体形态异常。7.过表达Parkin对病理性DJ-1L166P突变细胞线粒体稳态的影响。检测DJ-1WT组、DJ-1L166P组和DJ-1L166P+Parkin组的线粒体指标,结果显示,过表达Parkin可以保护DJ-1L166P突变引起的ROS积累和线粒体的膜电势降低。但DJ-1L166P组和DJ-1L166P+Parkin组在ATP含量和细胞凋亡的检测中均无明显差异。与DJ-1L166P组相比,DJ-1L166P+Parkin组线粒体片段明显减少。综上所述,在SH-SY5Y细胞中,下调DJ-1表达或过表达DJ-1L166P都可以增加细胞氧化应激水平,从而引起线粒体功能和形态异常。过表达Parkin可以降低线粒体氧化应激水平,对DJ-1下调表达或过表达DJ-1L166P细胞均有不同程度的保护作用。