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植物的生长发育受到多种环境因素的影响,如温度、湿度、光照、营养等。氮素在自然界中广泛存在,是植物生长发育最重要的大量元素之一。氮素不仅是营养元素,也是蛋白质、核酸及磷脂等生物大分子的重要组成成分。而对于影响生长的内因而言,蛋白质的合成是调控植物生长发育的重要因素。外源氨基酸作为土壤中的重要有机氮,在植物的生长发育中发挥着不可或缺的作用。然而,植物中关于外源氨基酸的作用研究存在争议。FERONIA作为一类受体蛋白激酶,直接调节下游因子EBP1的蛋白合成速率。基于此,本论文以Col-0、FERONIA突变体及过表达为材料,探究不同外源氨基酸对蛋白质合成的影响,主要获得了以下研究结果:
(1)外源添加的精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)以及甘氨酸(Gly)能够恢复Col-0缺氮表型,显著增加Col-0的鲜重及叶绿素含量(P<0.05)。表明拟南芥可以吸收外源氨基酸,且Arg、Ala、Asn、Gln、Asp和Gly可作为潜在的有机氮源被拟南芥吸收利用并促进植物的生长发育。
(2)缺氮处理后,Col-0主根长度显著高于未处理,并伴有侧根发生。添加Gln后,Col-0根系显著缩短(P<0.05),且趋向于恢复至未处理条件下(Mock)的根长,Col-0对Ala、Asn表现不敏感;Gly、Asp显著促进Col-0根系伸长(P<0.05)。此外,添加Arg后,Col-0根长显著缩短且短于Mock(P<0.05),但子叶发育正常。而添加另外7种氨基酸后,Col-0根长显著缩短且出现子叶发育不正常的现象。这说明不同氨基酸对植物根系生长的作用存在差异。
(3)35S∷EBP1-GFP荧光观察实验表明Gly、Ala、Arg和Gln能促进35S∷EBP1-GFP的荧光积累。通过核糖体密度梯度离心实验,进一步检测上述氨基酸处理下,各核糖体组分在A260nm处的吸光度值曲线及多聚核糖体组份(8-11层)中EBP1的mRNA相对表达量。发现Gly、Arg和Ala能在翻译层面促进EBP1的蛋白质积累。进一步检测3mM不同氨基酸处理后,野生型中EBP1的蛋白水平。发现与未处理相比,缺氮处理后,EBP1蛋白量降低。添加Ala及Gln后,EBP1蛋白量增加,说明Ala、Gln在蛋白水平上促进EBP1蛋白质的积累。
(4)fer-4对上述能够恢复Col-0缺氮表型的6种氨基酸不响应。采用广泛靶向代谢组学技术,对Col-0和fer-4的代谢组份进行对比分析。共检测到804种代谢物,其中差异显著的代谢组成分有22类295种,有127种成分上调,168种成分下调。上调的差异代谢产物中主要有原花青素、花青素等,表明FERONIA参与拟南芥氮代谢过程,并在调节营养代谢的动态平衡中起着关键作用。进一步通过KEGG富集分析,得到Col-0与fer-4代谢物质富集最显著的前20条差异相关的关键通路,其中有1条氨基酸合成途径,3条氨基酸代谢途径。研究结果暗示FERONIA突变后,fer-4对氨基酸不敏感可能源于氨基酸代谢通路异常。且由于氨基酸是蛋白质合成的关键组成成分,FER可能参与蛋白质的合成过程。
综上所述,本研究发现外源氨基酸可促进EBP1蛋白质合成,且FERONIA突变后导致代谢紊乱。
(1)外源添加的精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)以及甘氨酸(Gly)能够恢复Col-0缺氮表型,显著增加Col-0的鲜重及叶绿素含量(P<0.05)。表明拟南芥可以吸收外源氨基酸,且Arg、Ala、Asn、Gln、Asp和Gly可作为潜在的有机氮源被拟南芥吸收利用并促进植物的生长发育。
(2)缺氮处理后,Col-0主根长度显著高于未处理,并伴有侧根发生。添加Gln后,Col-0根系显著缩短(P<0.05),且趋向于恢复至未处理条件下(Mock)的根长,Col-0对Ala、Asn表现不敏感;Gly、Asp显著促进Col-0根系伸长(P<0.05)。此外,添加Arg后,Col-0根长显著缩短且短于Mock(P<0.05),但子叶发育正常。而添加另外7种氨基酸后,Col-0根长显著缩短且出现子叶发育不正常的现象。这说明不同氨基酸对植物根系生长的作用存在差异。
(3)35S∷EBP1-GFP荧光观察实验表明Gly、Ala、Arg和Gln能促进35S∷EBP1-GFP的荧光积累。通过核糖体密度梯度离心实验,进一步检测上述氨基酸处理下,各核糖体组分在A260nm处的吸光度值曲线及多聚核糖体组份(8-11层)中EBP1的mRNA相对表达量。发现Gly、Arg和Ala能在翻译层面促进EBP1的蛋白质积累。进一步检测3mM不同氨基酸处理后,野生型中EBP1的蛋白水平。发现与未处理相比,缺氮处理后,EBP1蛋白量降低。添加Ala及Gln后,EBP1蛋白量增加,说明Ala、Gln在蛋白水平上促进EBP1蛋白质的积累。
(4)fer-4对上述能够恢复Col-0缺氮表型的6种氨基酸不响应。采用广泛靶向代谢组学技术,对Col-0和fer-4的代谢组份进行对比分析。共检测到804种代谢物,其中差异显著的代谢组成分有22类295种,有127种成分上调,168种成分下调。上调的差异代谢产物中主要有原花青素、花青素等,表明FERONIA参与拟南芥氮代谢过程,并在调节营养代谢的动态平衡中起着关键作用。进一步通过KEGG富集分析,得到Col-0与fer-4代谢物质富集最显著的前20条差异相关的关键通路,其中有1条氨基酸合成途径,3条氨基酸代谢途径。研究结果暗示FERONIA突变后,fer-4对氨基酸不敏感可能源于氨基酸代谢通路异常。且由于氨基酸是蛋白质合成的关键组成成分,FER可能参与蛋白质的合成过程。
综上所述,本研究发现外源氨基酸可促进EBP1蛋白质合成,且FERONIA突变后导致代谢紊乱。