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环脂肽类物质具有抗真菌、抗病毒、抗细菌、抗肿瘤等生物活性，在食品、农业、医药等领域应用前景广泛。Plipastatin是一类由非核糖体多肽合成酶催化合成的环脂肽类化合物，对丝状真菌具有良好的抑制作用，被广泛应用于植物病害的生物防治，在果蔬采后贮藏保鲜和饲料加工储藏中也能起到抑制真菌生长、减少真菌毒素的作用。因此，开展Plipastatin生物合成相关研究，构建表达Plipastatin及其类似物的工程菌株，发掘新型Plipastatin衍生物，对于农业生物防治和食品加工、贮藏技术改良等具有重要的研究意义和价值。
本研究对香椿内生细菌进行分离、鉴定，并以NRPS功能基因为靶点进行筛选，得到4株含有NRPS基因的内生细菌。经进一步生物信息学分析，发现HYM-12中含有与Plipastatin生物合成基因簇相似度为86％的合成基因簇，以其为研究对象，采用转化偶联重组(Transformation Associated Recombination，TAR)技术，利用特异性捕获载体在酿酒酵母中实现目标基因簇的克隆，并导入改造宿主进行异源表达，以期获得Plipastatin产物及其类似物。主要研究结果如下:
1.香椿内生细菌的分离与鉴定。从香椿中分离纯化了12株内生细菌，编号为HYM-1-HYM-12，采用分子生物学手段结合形态学观察将这些菌株分别鉴定为Bacillus velezensis、Enterobacter mori、Raoultella terrigena、Chryseobacterium joostei、Acinetobacter johnsonii、Bacillus megaterium、Brevibacterium frigoritolerans、Raoultella ornithinolytica、Paenibacillus hordei、Acinetobacter oryzae、Enterobacter soli、Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum。
2.基于非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase，NRPS)基因定向筛选含有Plipastatin生物合成基因簇的菌株。在内生细菌鉴定的基础上，以NRPS功能基因为靶点定向筛选到4株内生细菌含有NRPS基因，以NRPS基因构建系统发育树结合文献报道，发现菌株HYM-12(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)的次级代谢产物种类较为丰富且可能具有合成Plipastatin的潜力。利用antiSMASH对其全基因组分析发现12个基因簇中有5个基因簇包含NRPS基因，经同源性比较发现基因簇与Plipastatin生物合成基因簇相似度为86％，提示该基因簇可能具有产生环脂肽Plipastatin的潜力。
3.表达Plipastatin工程菌株的构建。选择与Plipastatin生物合成基因簇来源母体菌株亲缘性较近的Bacillus subtilis为异源宿主。利用Zeo、PxylA、mazF基因构建最小敲除盒子，通过overlap PCR在最小敲除盒子两端融入同源臂，经同源重组结合毒性胁迫成环脱除异源宿主B.subtilis1A751中的Plipastatin天然生物合成基因，得到工程菌株B.subtilis1A751Δpps。
4.Plipastatin生物合成基因簇表达载体的构建。设计特异性引物扩增sfp、degQ和Plipastatin生物合成基因簇ppsA-E上下同源臂，经overlap PCR融合后，采用酶切酶连法与经线性化的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pCAPB2相连。得到Plipastatin生物合成途径特异性捕获载体。
5.Plipastatin生物合成基因簇的表达。通过TAR技术，利用经线性化的特异性捕获载体在酿酒酵母中实现Plipastatin生物合成基因簇的克隆，得到重组质粒pCAPB2-ppsA-E+sfp+degQ。通过原生质体转化法将重组质粒导入经改造的异源宿主B.subtilis1A751Δpps中，建立Plipastatin异源表达系统B.subtilis1A751Δpps,amyE::ppsA-E+sfp+degQ。Plipastatin经发酵表达后，有机溶剂萃取发酵产物，采用高效液相色谱、电喷雾质谱及高效液相一质谱技术对萃取物进行分析，结果袁明成功实现Plipastatin生物合成基因簇在改造宿主中的表达。
目前，利用枯草芽孢杆菌作为异源宿主表达环脂肽的研究罕见报道，且缺乏有效的穿梭载体和可利用的商业化工程菌株，克隆过程中亦存在诸多技术瓶颈。该研究为异源表达环脂肽类化合物及其类似物奠定基础，为利用TAR技术克隆大片段基因簇和实现枯草芽孢杆菌中的异源表达提供了新的策略。
本研究对香椿内生细菌进行分离、鉴定，并以NRPS功能基因为靶点进行筛选，得到4株含有NRPS基因的内生细菌。经进一步生物信息学分析，发现HYM-12中含有与Plipastatin生物合成基因簇相似度为86％的合成基因簇，以其为研究对象，采用转化偶联重组(Transformation Associated Recombination，TAR)技术，利用特异性捕获载体在酿酒酵母中实现目标基因簇的克隆，并导入改造宿主进行异源表达，以期获得Plipastatin产物及其类似物。主要研究结果如下:
1.香椿内生细菌的分离与鉴定。从香椿中分离纯化了12株内生细菌，编号为HYM-1-HYM-12，采用分子生物学手段结合形态学观察将这些菌株分别鉴定为Bacillus velezensis、Enterobacter mori、Raoultella terrigena、Chryseobacterium joostei、Acinetobacter johnsonii、Bacillus megaterium、Brevibacterium frigoritolerans、Raoultella ornithinolytica、Paenibacillus hordei、Acinetobacter oryzae、Enterobacter soli、Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum。
2.基于非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase，NRPS)基因定向筛选含有Plipastatin生物合成基因簇的菌株。在内生细菌鉴定的基础上，以NRPS功能基因为靶点定向筛选到4株内生细菌含有NRPS基因，以NRPS基因构建系统发育树结合文献报道，发现菌株HYM-12(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)的次级代谢产物种类较为丰富且可能具有合成Plipastatin的潜力。利用antiSMASH对其全基因组分析发现12个基因簇中有5个基因簇包含NRPS基因，经同源性比较发现基因簇与Plipastatin生物合成基因簇相似度为86％，提示该基因簇可能具有产生环脂肽Plipastatin的潜力。
3.表达Plipastatin工程菌株的构建。选择与Plipastatin生物合成基因簇来源母体菌株亲缘性较近的Bacillus subtilis为异源宿主。利用Zeo、PxylA、mazF基因构建最小敲除盒子，通过overlap PCR在最小敲除盒子两端融入同源臂，经同源重组结合毒性胁迫成环脱除异源宿主B.subtilis1A751中的Plipastatin天然生物合成基因，得到工程菌株B.subtilis1A751Δpps。
4.Plipastatin生物合成基因簇表达载体的构建。设计特异性引物扩增sfp、degQ和Plipastatin生物合成基因簇ppsA-E上下同源臂，经overlap PCR融合后，采用酶切酶连法与经线性化的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pCAPB2相连。得到Plipastatin生物合成途径特异性捕获载体。
5.Plipastatin生物合成基因簇的表达。通过TAR技术，利用经线性化的特异性捕获载体在酿酒酵母中实现Plipastatin生物合成基因簇的克隆，得到重组质粒pCAPB2-ppsA-E+sfp+degQ。通过原生质体转化法将重组质粒导入经改造的异源宿主B.subtilis1A751Δpps中，建立Plipastatin异源表达系统B.subtilis1A751Δpps,amyE::ppsA-E+sfp+degQ。Plipastatin经发酵表达后，有机溶剂萃取发酵产物，采用高效液相色谱、电喷雾质谱及高效液相一质谱技术对萃取物进行分析，结果袁明成功实现Plipastatin生物合成基因簇在改造宿主中的表达。
目前，利用枯草芽孢杆菌作为异源宿主表达环脂肽的研究罕见报道，且缺乏有效的穿梭载体和可利用的商业化工程菌株，克隆过程中亦存在诸多技术瓶颈。该研究为异源表达环脂肽类化合物及其类似物奠定基础，为利用TAR技术克隆大片段基因簇和实现枯草芽孢杆菌中的异源表达提供了新的策略。