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第一部分 门冬酰胺酶相关胰腺炎(AAP)的临床分析目的:分析急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)儿童门冬酰胺酶相关胰腺炎(asparaginase associated pancreatitis,AAP)的临床表现、诊断及治疗经过,目的在于提高ALL儿童AAP的诊断治疗水平,改善临床预后。方法:回顾性分析2014年1月至2018年9月期间在我院诊断并接受化学治疗的ALL患儿共158例,全部患儿均给予包含培门冬酶的联合化疗,分析发生AAP的12例患儿的临床特点、诊治经过和转归情况。结果:4年多中我院共收治ALL患儿158例,包含培门冬酶联合化疗后AAP发生率为7.6%(12/158);并将ALL患儿分成AAP组及未患AAP组,在性别、初诊时的白细胞计数、白血病的免疫分型、临床危险度两组之间均无差异(P>0.05)。值得注意的是,≥10岁年龄组AAP发生率是12.5%,<10岁年龄组AAP发生率是6.7%,但P>0.05,结果无统计学差异。AAP发生在最近一次培门冬酶使用后的1-41天(中位时间14.5天),使用2-8次后(中位次数2.5次)。AAP患儿主要的临床表现为腹痛、呕吐(腹痛12例,呕吐11例)。诊断AAP72小时内血淀粉酶最高值125-999 U/L(中位值356.5 U/L)、血脂肪酶最高值175-1923 U/L(中位值333U/L)。胰腺CT检查5例有胰腺肿大,周围有渗出。胰腺B超检查7例有胰腺增大。12例AAP患儿均给予禁食、生长抑素、奥美拉唑,补液、维持水电解质酸碱平衡。其中7例放置鼻空肠管,1例连续性肾脏替代疗法(continuous renal replacement therapy,CRRT),1 例放置胰管支架,1 例并发胰腺假性囊肿。无一例死于AAP,1例患儿(例4)死于原发病复发。结论:本研究提示培门冬酶在儿童ALL联合化疗中AAP发生率是7.6%,多数AAP发生在使用后14.5天,AAP可发生在培门冬酶治疗的各个阶段;患儿的性别、年龄、初诊时白细胞计数、临床危险度分级以及免疫分型均与AAP的发生无显著相关性。AAP主要临床表现为腹痛、呕吐,联合儿童消化科、儿童ICU(intensive care unit,ICU)、儿童外科等多学科合作对AAP患儿的救治起到至关重要的作用。第二部分 自噬相关基因ULK2的多态性与AAP易感性分析目的:对AAP患儿和对照组进行自噬相关基因ULK2的多态性分析,探讨ULK2基因的多态性与AAP发生的关系,希望找到AAP发生的预测指标。方法:对2014年1月至2018年9月期间在我院儿童血液肿瘤科使用培门冬酶治疗ALL患儿中发生AAP的12例(AAP组)、未患AAP146例(ALL对照组)和同时间段健康体检儿童(正常对照组)45例进行了ULK2基因的Sanger测序。结果:将所有样本进行27个外显子测序,参考美国国立生物技术信息中心所(national center for biotechnology information,NCBI)公布序列NM014683.3。ULK2基因测序共检测出4个突变位点,分别为EX0N1:-493C>T突变,EXON1:-308C>G突变,EXON11:+792A>G突变,EXON14:+1108G>A突变。经分析发现:EXON1:-493C>T、EXON1:-308C>G两个突变类型AAP组与对照组之间存在显著差异(P<0.01),而ALL对照组与正常对照组之间没有差异(P>0.05);均未见报道。EXON11:+792A>G、EXON14:+1108G>A两个突变类型各组之间没有差异(P>0.05),而且正常人群的突变频率也非常高,预示与疾病的关系不大。结论:AAP组患儿EXON1:-493C>T、EXON1:-308C>G突变频率显著高于ALL对照组和正常对照组(P<0.01),此类突变位点均未见报道;提示ULK2基因EXON1:-493、EXON1:-308多态性与AAP的发生有关。是否可以作为AAP发生的预测指标,因本研究病例数少,结论有待于进一步深入研究证实。第三部分 门冬酰胺酶相关胰腺炎大鼠模型的建立目的:建立大鼠门冬酰胺酶相关胰腺炎的动物模型。方法:健康SD大鼠102只,雌雄各半,体重150-210g,在室温20-26℃,相对湿度45-65%的实验室内喂养一周适应后准备造模,实验前禁食12h,但不禁饮。随机分为3组,即:对照组(n=32)、实验1组(n=35)及实验2组(n=35)。本造模采用分次腹腔注射培门冬酶(PEG-asparaginase,PEG-ASP)(规格:3750U/5ml)的方法,分别按实验1组:150U/100g、实验2组300U/100g的剂量给予,2次腹腔内注射,两次间隔1小时。对照组:腹腔内注射等量的生理盐水2次,两次间隔1小时,最后一次注射完成后,禁食不禁饮。在造模开始后4个时间点(分别是6h、12h、24h及48h),分别采集三组大鼠心脏血3ml,分离制备血清,-80℃保存,用于大鼠血清淀粉酶的检测。在上述4个不同的时间点三组各自处死8只大鼠,逐层打开腹腔,先观察胰腺大体变化。按照上述4个不同的时间点取胰腺组织标本,固定、石蜡包埋、切片和苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色),并采取单盲法,在光镜下阅片,对胰腺组织进行病理学评分。结果:实验组大鼠PEG-ASP诱导6小时后血清淀粉酶升高,24-48小时达高峰,不同时间点均显著高于对照组(P<0.01),但是,两实验组之间不同时间点的差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组大鼠胰腺充血水肿明显、腹腔内肠管充血水肿明显、肠系膜血管充血水肿也明显。实验组6小时、12小时主要表现胰腺小叶、腺泡及细胞间隙增宽;24小时胰腺小叶结构破坏,细胞排列紊乱;48小时在细胞排列紊乱的基础上出现出血灶、坏死灶。与对照组比较,两实验组(实验1组和实验2组)胰腺组织病理评分明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01);两实验组比较病理评分无统计学差异(P>0.05),胰腺组织损伤24-48小时达高峰,病理评分明显高于12小时组,差异显著有统计学意义(P<0.01)。结论:通过腹腔2次注射培门冬酶成功建立大鼠AAP模型,由于实验1组的方法更经济,因此我们推荐150U/100g剂量的培门冬酶分次腹腔注射作为大鼠AAP模型。此模型具有制作方法简单、方便,重复性较好,胰腺组织病理变化比较均一等优点。第四部分 自噬抑制剂对门冬酰胺酶相关胰腺炎模型大鼠的保护作用目的:探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和氯喹(chloroquine,CQ)对大鼠门冬酰胺酶相关胰腺炎的保护作用。方法:健康SD大鼠30只,雌雄各半,随机分为3组,即:培门冬酶腹腔注射急性胰腺炎组(AAP组)(对照组)(n=10)、3-甲基腺嘌呤干预组(3-MA组)(n=10)及氯喹干预组(CQ组)(n=10)。采用分次腹腔注射培门冬酶的方法,按150U/100g剂量给予,2次腹腔内注射,两次间隔1小时。3-MA组在建立AAP模型前30 min腹腔注射3-MA(15mg/kg)。CQ组在建立AAP模型前30 min腹腔注射CQ(5mg/kg)。最后一次注射完成后,禁食不禁饮。在造模开始24h时间点,分别采集三组大鼠心脏血3ml,分离制备血清,-80℃保存,用于检测大鼠血清淀粉酶。在上述24h时间点三组分别处死8只大鼠,打开腹腔,观察胰腺大体变化;取胰腺组织标本,固定、石蜡包埋、切片和HE染色,采取单盲法在光镜下读片,进行胰腺组织病理学评分。结果:自噬抑制剂干预组(3-MA组、CQ组)大鼠血清淀粉酶均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),但是,两干预组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。对照组大鼠胰腺水肿明显,腹腔内肠管充血明显,肠系膜血管充血水肿明显;自噬抑制剂干预组(3-MA组、CQ组)大鼠胰腺水肿程度较对照组减轻、腹腔内肠管有水肿、但充血明显减轻,肠系膜血管充血水肿程度较对照组减轻。对照组胰腺小叶结构破坏,细胞排列紊乱;自噬抑制剂干预组(3-MA组、CQ组)主要表现胰腺小叶、腺泡及细胞间隙增宽,细胞排列欠整齐,较对照组明显好转。两干预组(3-MA组、CQ组)与对照组相比,胰腺组织病理评分减少,差异均有统计学意义(P<0.01);两干预组相比,病理评分无统计学差异(P>0.05)。结论:自噬抑制剂(3-MA和CQ)对门冬酰胺酶相关胰腺炎模型大鼠有保护作用。