第一部分:miR-449a调控胶质瘤干细胞重塑的免疫微环境中恶变巨噬细胞糖代谢及恶性表型的分子机制背景与目的:miR-449a参与恶性肿瘤增殖、转移及上皮间质化,但其如何调控肿瘤细胞糖代谢,特别是胶质瘤干细胞重塑的免疫微环境中恶变巨噬细胞（tMΦ）的糖代谢及其恶性表型的研究尚无报道。肿瘤免疫微环境中的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）分为M1和M2两型,前者具备“促炎抑瘤”表型,而后者发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用。我们在报告胶质瘤干细胞重塑的免疫微环境中巨噬细胞和树突状细胞等免疫相关细胞可发生恶性转化及其相关分子机制基础上,进一步探索了非编码RNA miR-449a调控胶质瘤免疫微环境中恶变巨噬细胞的糖代谢及恶性表型的分子通路及相关机制,旨在为胶质瘤的免疫靶向治疗提供新的策略和实验依据。方法:首先通过在线数据库生物信息学分析及验证,筛选出MCT1的上游调控miRNA为miR-449a,然后探索miR-449a/MCT1通路调控tMΦ糖代谢的分子机制。自胶质瘤干细胞微环境克隆的恶变巨噬细胞（tMΦ1细胞）,分别以RNA干扰和过表达技术建立不同miR-449a表达水平的tMΦ1细胞株。再应用q-PCR和Western-blot技术分析上调miR-449a表达后MCT1的基因和蛋白水平表达变化,然后以双荧光素酶实验验证miR-449a的靶基因为MCT1,分析miR-449a与MCT1之间的调控关系。分别对NC组（tMΦ1细胞）、miR-449a组（转染miR-449a mimics的tMΦ1细胞）和miR-449a+MCT1组（共转染miR-449amimics+MCT1质粒的tMΦ1细胞）进行细胞外乳酸含量测定,分析miR-449a对tMΦ1糖酵解的调控作用。并分别对NC组、miR-449a组和miR-449a+MCT1组进行克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验,观察不同组别相关细胞的生物学表型改变,分析miR-449a、MCT1及miR-449a+MCT1共转染对tMΦ1细胞恶性表型的影响。分别以0、25、50、75、100、125μmol/L浓度的3-溴丙酮酸（3-BrPA）处理tMΦ1细胞48h或72h后,CCK-8法测定细胞活性并绘制生存曲线,并依次行细胞乳酸分泌测定、克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验,分析3-BrPA对tMΦ1细胞糖酵解和恶性表型的影响。使用q-PCR技术测定3-BrPA作用tMΦ1细胞前后miR-449a的表达,分析3-BrPA对miR-449a的调控关系。使用q-PCR和Western blot技术,分析3-BrPA对MCT1的表达的影响。分别对NC组（tMΦ1细胞）、MCT1（转染MCT1质粒的tMΦ1细胞）组、3-BrPA组（3-BrPA处理的tMΦ1细胞）和3-BrPA+MCT1组（3-BrPA处理转染MCT1质粒的tMΦ1细胞）进行细胞乳酸分泌水平测定,分析MCT1对tMΦ1细胞糖代谢的影响。最后分别对NC组、MCT1组、3-BrPA组和3-BrPA+MCT1组的tMΦ1细胞进行克隆形成实验、transwell迁移和侵袭实验,分析MCT1对tMΦ1恶性表型的影响及使用3-BrPA干预后对转染MCT1质粒前后的tMΦ1细胞生物学特性的影响。结果:双荧光素酶实验显示miR-449a可显著抑制转染野生型MCT1-3’UTR的细胞的荧光素酶活性,但对转染突变型MCT1-3’UTR的细胞的荧光素酶活性没有影响,证实 miR-449a 的靶基因为 MCT1。使用 q-PCR和 Western blot 分析 miR-449a 与 MCT1之间的调控关系,结果表明转染miR-449a mimics后tMΦ1细胞内MCT1无论在基因水平还是在蛋白水平均表达下调,提示过表达miR-449a可抑制MCT1的表达。功能实验结果表明,过表达miR-449a降低了tMΦ1细胞的乳酸分泌、克隆形成、迁移和侵袭能力,转染MCT1质粒阻断了 miR-449a对tMΦ1细胞的乳酸分泌、克隆形成、迁移和侵袭的抑制。3-BrPA抑制tMΦ1细胞的增殖存在剂量依赖的相关性和时间依赖性,3-BrPA浓度越高,抑制能力越强。3-BrPA作用tMΦ1细胞的半抑制浓度（IC50）更接近100μmol/L,并在后续实验以100 μmol/L浓度作为3-BrPA的干预剂量。100μmol/L的3-BrPA作用48 h后观察对tMΦ1细胞糖代谢和恶性表型的影响,发现3-BrPA可明显降低tMΦ1细胞乳酸分泌水平,提示细胞糖酵解受抑制,同时tMΦ1细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力亦明显下降。使用q-PCR和Western blot分析3-BrPA对miR-449a和MCT1的调控关系结果显示3-BrPA可以上调tMΦ1细胞miR-449a的表达,抑制tMΦ1细胞MCT1的表达。转染MCT1可增加tMΦ1细胞乳酸分泌,并阻断3-BrPA对tMΦ1细胞乳酸分泌的抑制;转染MCT1可增强tMΦ1细胞的恶性表型,表现为克隆形成、迁移和侵袭能力增强,并阻断3-BrPA对tMΦ1细胞恶性表型的抑制。结论:胶质瘤干细胞重塑的微环境内恶变巨噬细胞乳酸分泌增加,糖酵解增强。miR-449a可抑制糖代谢相关靶基因MCT1的表达,抑制tMΦ1细胞的糖酵解活性和恶性表型,而3-BrPA可由miR-449a/MCT1通路发挥抑制tMΦ1细胞的恶性表型。这些研究结果明确了 miR-449a调控胶质瘤微环境内恶变巨噬细胞糖代谢的分子机制,为胶质瘤的免疫靶向分子治疗提供了新策略。第二部分:胶质瘤干细胞来源的外泌体长链非编码RNA HOXC-AS3调控恶变巨噬细胞糖脂代谢的分子机制研究背景与目的:肿瘤相关巨噬细胞可被包括外泌体在内的肿瘤微环境中的多种信号分子调控,肿瘤细胞分泌的外泌体参与细胞间通讯并有助于肿瘤进展和免疫逃逸。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）作为外泌体内含物的重要组成,研究发现其与多种恶性肿瘤的进展、预后密切相关。但在胶质瘤干细胞诱导恶变的巨噬细胞的相关研究中未见报告。探明胶质瘤干细胞外泌体中lncRNA调控胶质瘤干细胞免疫微环境内恶变巨噬细胞糖、脂代谢的相关分子机制,将为靶向tMΦ免疫的胶质瘤治疗提供必要的实验依据。方法:根据lncRNA表达谱分析提示,tMΦ细胞存在多种lncRNA的表达谱失调,选择在tMΦ1、tMΦ2细胞均显著上调的lncRNAHOXC-AS3为研究对象,探索其调控糖、脂代谢的分子机制。首先通过检测正常巨噬细胞（MΦ）、tMΦ1、tMΦ2细胞乳酸分泌水平、葡萄糖摄取量、细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平,分析恶变巨噬细胞糖、脂代谢特征。Western-blot分析MΦ、tMΦ1、tMΦ2细胞内调控糖代谢的关键酶:葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、乳酸脱氢酶A（LDHA）、己糖激酶2（HK2）、丙酮酸激酶同工酶2（PKM2）和调控脂代谢的关键酶:钙调蛋白（CaM）、载脂蛋白E（ApoE）、激素敏感性甘油三酯脂肪酶（HSL）、肝X受体（LXR）的蛋白表达水平。q-PCR检测HOXC-AS3在MΦ、tMΦ1、tMΦ2细胞中的表达。shRNA法沉默靶分子HOXC-AS3,以细胞克隆形成、侵袭、致瘤能力等指标比较沉默HOXC-AS3前后tMΦ1、tMΦ2细胞恶性表型的变化。提取人胶质瘤干细胞SU5-1s-RFP细胞和正常星形胶质细胞培养液的外泌体,q-PCR验证外泌体内HOXC-AS3的表达,荧光显微镜下观察tMΦ加入胶质瘤干细胞来源外泌体后培养情况。SU5-1s、沉默HOXC-AS3表达的SU5-1s和正常星形胶质细胞的外泌体分别和shHOXC-AS3-tMΦ1、shHOXC-AS3-tMΦ2进行细胞克隆形成和侵袭实验,观察胶质瘤干细胞来源的外泌体HOXC-AS3对沉默HOXC-AS3表达后的tMΦ1、tMΦ2细胞的恶性表型影响。分别收集NC（tMΦ1、tMΦ2细胞）、shNC（转染空白对照的tMΦ1、tMΦ2细胞）、shHOXC-AS3组（沉默HOXC-AS3表达的tMΦ1、tMΦ2细胞）和HOXC-AS3组（转染质粒过表达HOXC-AS3的tMΦ1、tMΦ2细胞）细胞,提取总RNA,使用q-PCR技术分析沉默和增强HOXC-AS3前后,tMΦ1、tMΦ2细胞内基因LDHA和CaM的表达变化。在tMΦ1、tMΦ2细胞中对HOXC-AS3相关的蛋白复合物进行蛋白质组学分析,质谱分析筛选高度富集的蛋白,筛选出与HOXC-AS3相关性最高的糖、脂代谢基因。Western blot分析沉默hnRNPA1（与HOXC-AS3相关性最高的糖、脂代谢相关基因）前后tMΦ1、tMΦ2细胞内LDHA和CaM的蛋白表达变化。使用RNA免疫共沉淀（RIP）法,证实tMΦ1、tMΦ2细胞内HOXC-AS和hnRNPA1是否能形成复合物。q-PCR、Western blot分析沉默HOXC-AS3前后tMΦ1、tMΦ2细胞内HOXC-AS3相关性最高的糖、脂代谢相关基因的表达变化。结果:对tMΦ糖、脂代谢特征分析发现,tMΦ1和tMΦ2细胞葡萄糖摄取、细胞外乳酸分泌水平明显高于MΦ,糖酵解活性增强;tMΦ1和tMΦ2细胞内TG和TC水平亦高于MΦ,提示脂代谢水平亦增高;Western-blot提示:糖代谢相关酶GLUT1、HK2、PKM2、LDHA和脂代谢相关酶CaM、HSL、ApoE、LXR的表达水平均明显高于MΦ,其中以LDHA和CaM的表达上调较为显著。q-PCR结果证实tMΦ1、tMΦ2细胞中HOXC-AS3水平均高于MΦ,进一步探索HOXC对tMΦ的调控作用,以shRNA法沉默tMΦ1和tMΦ2细胞中HOXC-AS3后,发现tMΦ1和tMΦ2细胞的克隆形成、侵袭及致瘤能力均明显下降。q-PCR结果提示,SU5-1s的外泌体中的HOXC-AS3明显高于正常星形胶质细胞外泌体的HOXC-AS3,荧光显微镜下观察SU5-1s-RFP来源的红色荧光外泌体可被tMΦ吞噬。沉默HOXC-AS3表达后的tMΦ1、tMΦ2细胞和SU5-1s的外泌体共培养后,细胞克隆形成和侵袭能力又恢复至沉默前的较强水平,而与星形胶质细胞或沉默HOXC-AS3表达SU5-1s的外泌体共培养后,tMΦ1、tMΦ2细胞的克隆形成和侵袭能力未明显恢复,提示胶质瘤干细胞外泌体富含HOXC-AS3可被tMΦ吞噬后调控后者的增殖、侵袭活性。q-PCR结果表明,sh-RNA法沉默tMΦ1和tMΦ2中HOXC-AS3后,LDHA和CaM的表达水平也下降;同时,通过质粒转染提高HOXC-AS3表达水平后,tMΦ1和tMΦ2细胞内LDHA和CaM的表达水平也随之上调,HOXC-AS3和糖、脂代谢相关基因LDHA、CaM表达正相关。在tMΦ1和tMΦ2细胞中对HOXC-AS3相关的RNA和蛋白结合的复合物进行蛋白质组学分析,质谱分析筛选出的高度富集的蛋白中,发现核内不均一性核糖核蛋白A1（hnRNPA1）与HOXC-AS3的糖、脂代谢相关性最高。沉默hnRNPA1表达亦能够下调tMΦ1和tMΦ2细胞内LDHA和CaM的蛋白表达。RIP实验证实,hnRNPA1与HOXC-AS3可形成复合体。而沉默HOXC-AS3时,hnRNPA1的基因和蛋白表达无明显变化。结论:tMΦ1、tMΦ2细胞内糖、脂代谢水平高于正常MΦ。胶质瘤干细胞来源的外泌体HOXC-AS3可被恶变巨噬细胞吞噬后,通过与其靶基因hnRNPA1结合调节tMΦ1、tMΦ2细胞糖、脂代谢重构,靶向HOXC-AS3可抑制tMΦ1、tMΦ2细胞的恶性表型。这些结果证实了胶质瘤免疫微环境内恶变巨噬细胞发生代谢重构,并初步揭示了lncRNA HOXC-AS3调控tMΦ1、tMΦ2细胞的糖、脂代谢机制及对其生物学表型的影响,通过定向干预相关靶分子,有望为胶质瘤免疫靶向治疗提供新的实验依据。