研究背景骨整合(Osseointgration)理论提出及不断运用于实践,为现代口腔种植学的快速发展奠定坚实的基础。随着科学技术和口腔种植体材料学的不断发展以及临床上为了满足不同患者的不同的需求的基础上,学者们提出了现代种植学的基本目标是恢复患者正常的咀嚼,言语,健康和美观等四大功能。为了达到以上的目标,相关研究工作者在前人的基础上继续致力于改善纯钛种植体的表面处理,以期获得更快速,有效的骨结合性能满足日益增长的临床需求。种植体植入后骨组织愈合模式主要有两种,接触成骨和距离成骨：接触成骨是指成骨细胞在种植体表面接触后直接分泌骨基质,新生的骨基质直接沉积在种植体表面,其生长方向是由种植体表面向旧骨组织生长；距离成骨与之相反,新生骨基质沉积在种植体附近和周围的旧骨组织表面,其生长的方向为旧骨组织向种植表面生长。Davies等研究指出这两种愈合方式揭示骨引导作用及编织骨的形成是骨结合形成中的关键步骤,正是由于这些骨基质的形成,种植体得以锚定在种植位点。接触成骨的最主要的过程是能够尽早的建立生物学基质(血凝块),间充质细胞可从中迁移,粘附于种植体表面后,既而增殖和分化成为成骨细胞,最终在种植体表面沉积新的骨基质。尽快建立接触成骨所需的条件的优化,有利于促进骨组织形成。骨组织愈合的速率和程度依赖于种植体表面接触成骨的程度。Pokharau等研究接触成骨在种植体表面直接形成的编制骨有利于增加种植体初期和早期的机械稳定性。近年来,相关研究热点关注接触成骨与可直接发生在经过表面处理的种植材料的表面,其中材料经表面处理后是否具有骨引导性能是影响接触成骨的关键因素。1997年Wang等领导的研究小组,首次使用紫外线对二氧化钛膜进行表面处理,发现经处理过的二氧化钛膜层由疏水性能向超亲水性能转变。但Carlsson等体内实验研究认为具有亲水性表面的种植体难以表现出更高的骨结合效能。而Buser等指出亲水性种植体与传统的种植体相比具有更高的骨-种植体接触率。随后学者们对紫外线的光催化作用逐渐运用到种植体的表面改性中,以期通过一种非化学性,非生物性的处理方法来提高种植体的表面能,提高纯钛种植体骨引导性能,促进和加快种植体表面接触成骨的发生,缩短种植体临床愈合时间。前期的大量的研究表明经过表面处理(如机械表面处理,大颗粒的喷砂酸蚀)纯钛种植体在无菌和密闭的环境中存储,随着存储时间的增加,碳原子的含量逐渐增加,一方面增大了种植体的体积,另外一方面减少成骨细胞的接触和蛋白的吸附。近年来,大量的研究发现,临床上使用的种植体表面存在的碳氢化合物的污染,种植体表面的生物活性的下降与其表面碳原子的增加两者之间具有统计学意义上相关性。结合近年来关于表面处理研究技术发展趋势,是结合多种表面处理方法,取长补短,发挥各种处理方法的特点和优势,向综合性的表面处理方向发展,其最终目标都是朝着提高种植体的骨引导性能和生物相容性,促进种植体表面直接的骨沉积从而提高种植体结合力。与传统的表面处理技术相比较,UV作为一种新的处理方法,具有简单,高效性能,不需要通过增加原种植体表面处理后的形貌或改变表面的化学元素等。本课题组前期通过对喷砂酸蚀的纯钛表面添加紫外线光催化作用的理化实验和细胞实验中研究表明,UV处理可以不改变表面的化学形貌和粗糙度情况下,表面获得大量的亲水性基团-OH, MG63成骨细胞体外生物活性检测在各个时间点1d,7d,14d中,与疏水性的SLA表面相比较,更加促进细胞的粘附,增殖,分化和矿化。在前期研究的基础上,我们初步预期使用紫外线对纯钛进行表面处理可以提高骨引导性能。本实验的目的是从动物实验的角度进一步验证不同表面形貌(即机械处理表面和喷砂酸蚀表面)经紫外线光催化作用的骨引导性能及动物体内早期成骨效能。目的1.对传统运用纯钛帽进行改良,探讨其植入兔颅骨动物模型实验研究的可行性,以期为种植体表面处理的动物研究提供一种可靠、高效、简便、重复性良好动物模型。2.探讨紫外线光催化不同表面形貌(即机械处理表面与喷砂酸蚀表面)纯钛帽植入兔颅骨的初期时间段(2w,4w,6w)骨引导性能及成骨效能,为紫外线运用于表面处理方式提供进一步的动物实验依据。材料与方法1.材料健康、成年、雌性新西兰大白兔18只,由广东省医学动物实验中心提供。纯钛板Gr2由Titanium Metal Corporation提供。纯钛帽经广州市吉峰金属塑胶制品有限公司加工制作为中空半球形钛帽(外径7.0mm、内径6.0mm,厚度0.5mm、深度3.0mm),底部添加渐进性自攻性螺纹(螺纹高度2.0mm,牙距0.45mm、牙深0.35mm),顶部添加两个直径为0.8mm环形小孔。2.钛帽内表面处理方法及分组情况纯钛帽表面处理方法参照本实验组前期的研究结果。样本经机械处理后为T组,紫外光处理后为T-UV组。部分实验样本经120μm Al2O3喷砂后经18%HCl和49%H2SO4混合溶液,60℃酸蚀30min后,去离子水超声荡洗15min,室温干燥24h,制备SLA组；在此基础上经紫外光处理后制备SLA-UV组。3.动物模型的建立18只兔子严格按照无菌操作的具体流程进行,在兔子颅骨上制备4个环形裂隙,植入四个不同表面处理的纯钛帽。术后使用抗生素进行预防感染。处死前的13天、14天在颈部皮下注射四环素30mg/kg,处死前的3天、4天颈部皮下注射钙黄绿素6mg/kg.所有动物按照观察时间点2w,4w,6w分别处死。将每只兔子颅骨上纯钛帽合并颅骨完整取出进行初步修整后放入10%中性福尔马林溶液中进行固定。4.制作不脱钙组织切片及组织学观察将获得的标本按照不同浓度的乙醇进行逐级脱水,氯仿透明,甲基丙烯酸甲酯浸润及逐级固化后,LEICA S P1600硬组织切片机切割150μm厚度骨磨片,手工磨片至100μm时,移至荧光显微镜下观察。随后继续手工磨片至于30μm,亚甲基蓝-酸性品红染色。光学显微镜下观察新生骨组织的形态及通过图像测量软件获得相关的检测指标的实验数据。5.检测指标①矿化新生骨组织的百分比(mineralized bone, MB%)=新生矿化骨组织的量(the newly mineralized formed bone tissue)/钛帽内总面积(the total spaces of the inner dome)*100%②新生总骨量百分比(newly formed total bone, TB%)=新生骨组织总量(the newly formed total bone)/钛帽内总面积(the total spaces of the inner dome)*100%③骨组织-钛帽结合率(bone-implant contact, BIC)=骨组织-钛帽结合长度(the length of new trabecular bone in contact with inner surface of dome)/钛帽内表面长度(the length of the inner dome)*100%6.统计学分析运用SPSS13.0统计软件对实验获取的各类检测指标的数据进行归类,整合及分析。首先用析因方差对不同形貌,不同的处理方式及不同时间段进行初步分析,若存在交互效应后则对各个时间段内进行两独立样本t检验的分析。结果1.术后观察术后所有的动物恢复良好,术后5天内动物精神状况疲惫,运动较少,进食减少。1w后所有的动物基本恢复正常。处死后观察所有的钛帽均无松动,脱落或移位现象。大体标本观察纯钛帽周围大量的纤维软组织包裹,随着观察时间点的不同,纤维组织有增长的趋势,部分纤维组织沿着纯钛帽上的小孔长入纯钛帽形成的空腔中。2.荧光显微镜观察：通过荧光显微镜观察到纯钛帽内新生骨组织,呈现亮绿色。新生骨沿着钛帽的内侧壁向上生长。新生骨组织与旧骨组织之间形成明显的界限。矿化的骨小梁为亮绿色,与周围的骨髓腔,软组织形成鲜明的对比。2w时,各组内新生少量薄层的骨组织沉积颅骨表面。T组内新生骨与钛帽无直接接触,T-UV组与SLA-UV组分别较T组与SLA组多,且骨组织直接接触钛帽。4w时,各组钛帽内新生骨量进一步增加,部分软组织长入钛帽内部。其中SLA-UV组新生骨组织最多,T-UV组与SLA-UV组内见新生骨组织沿着钛帽内侧部向上生长,矿化骨小梁紧贴钛帽内侧壁生长,部分甚至到达钛帽上1/3。6w时,各个钛帽内新生骨量生长速度较慢,SLA-UV组与SLA组荧光显示的新生骨量差别不大,T-UV组内新生骨量较T组内多。3.光学显微镜观察：亚甲基蓝-酸性品红染色后在光学显微镜下可观察到,矿化成熟的骨小梁染色为深红色,类骨质,纤维组织为蓝色。随着观察时间点的延长,各组内新生骨组织逐渐增加,在2w到4w期间,新生骨组织生长速度较快。在4w到6w期间骨组织生长速度较缓慢。2w时,各组之间仅有少量的矿化的骨小梁生成,骨小梁薄梭形,条索状多见；与T相比,T-UV组,SLA-UV组与SLA组可见矿化小梁直接与钛帽的内侧壁接触。4w时,各组之间的新生骨组织进一步增加,骨小梁形态逐渐变粗,呈现出进行性矿化。部分软组织长入钛帽内部。新生骨小梁锚定在颅骨表面,除T组外,其余的三组新生骨小梁与钛帽内侧壁紧密接触,但是在各组接触的高度不同。T-UV组与SLA-UV新生骨组织与钛帽内侧接触及生长高度最明显,几乎到达顶部1/3。6w时,软组织继续生长占据一定的空间,新生骨组织生长空间受限。骨小梁逐渐矿化沉积加粗,相互连接成网状和片状,T-UV组及SLA-UV组新生骨组织及钛帽与矿化骨小梁接触均高于T组于与SLA组。4.统计分析结果经过析因分析结果发现不同的表面形貌,不同的时间点,不同的处理因素之间各个观测指标存在差异,采用两独立样本t检验。具体结果如下：2w时,各组的矿化新生骨组织占整个钛帽总面积的百分比的均数如下：T-UV组(3.800±1.640)%>T组(2.350±1.411)%,SLA-UV组(6.178±3.989)%>SLA组(4.239±1.812)%,各组数据经t检验后,均未达到统计学上的差异。各组新生总骨量占整个钛帽总面积百分比均数如下：T-UV组(16.363±8.7590)%>T组(10.062±7.057)%,SLA-UV组(22.625±16.417)%>SLA组(17.627±7.933)%,各组经t检验后,均未达到统计学上的差异。各组新生骨组织-钛帽接触率的均数如下：T-UV组(6.622±1.297)%>T组(4.208±2.228)%,SLA-UV组(17.003±7.552)%>SLA组(8.653±2.813)%,各组数据经t检验后,前者(P=0.048<0.05)与后者(P=0.029<0.05)均达到统计学上的差异。4w时,各组的矿化新生骨组织占整个钛帽总面积的百分比的均数如下：T-UV组(12.596±5.028)%>T组(9.590±5.317)%,SLA-UV组(16.825±6.892)%>SLA组(9.899±3.729)%,各组数据经t检验后,均未达到统计学上的差异。各组新生总骨量占整个钛帽总面积百分比均数如下：T-UV组(44.714±13.803)%>T组(32.975±15.619)%,SLA-UV组(59.006±23.990)%>SLA组(33.115±12.111)%,各组数据经t检验后,前者未达到统计学上差异,后者达到统计学上的差异(P=0.048<0.05)。各组新生骨组织-钛帽接触率的均数如下：T-UV组(30.850±13.741)%>T组(15.168±6.648)%,SLA-UV组(43.144±13.352)%>SLA组(23.634±15.321)%,各组数据经t检验后,P值分别为(P=0.039<0.05)与(P=0.041<0.05),两者均达统计学上差异。6w时,各组的矿化新生骨组织占整个钛帽总面积的百分比的均数如下：T-UV组(13.956±3.740)%>T组(10.094±2.470)%,SLA-UV组(17.087±3.097)%>SLA组(13.021±2.639)%,各组数据经t检验后,两者均未达到统计学上的差异。各组新生总骨量占整个钛帽总面积百分比均数如下：T-UV组(45.353±16.423)%>T组(33.057±4.300)%,SLA-UV组(63.556±19.870)%>SLA组(55.296±15.819)%,各组数据经t检验后,前者(P=0.031<0.05)达到统计学上差异,后者未达到统计学上的差异。各组新生骨组织-钛帽接触率的均数如下：T-UV组(25.805±8.332)%>T组(16.167±2.879)%,SLA-UV组(53.961±14.257)%>SLA组(35.778±9.819)%,各组经t检验后,前者(P=0.036<0.05)与后者均达统计学上差异(P=0.030<0.05)。结论1.改良自攻性纯钛帽制作加工相对传统的钛帽工艺简单,重复性良好,加工成品规格形变小。自攻性螺纹增加钛帽稳定性,减少辅助固定装置。改良自攻性纯钛帽在兔颅骨动物实验模型中的运用,减少手术创伤,简化操作步骤,提高实验效率,更加客观可靠反映植入物生物相容性。改良自攻性纯钛帽是种植体表面处理方式的一种具有应用前景的动物实验模型。2.不同形貌的纯钛帽表面经紫外线光催化后植入兔颅骨,表现出良好的生物相容性和骨引导性能；T-UV组,SLA-UV组骨引导性能分别优于T组,SLA组。机械处理表面和喷砂酸蚀表面复合UV光催化作用能够显著提高纯钛表面的骨引导性能,促进钛-骨组织界面上新生骨组织的直接沉积,矿化,加速接触成骨过程。3.紫外线表面处理方法是一种相对简单的干净的技术,不需要附加或增加化学的方法改变纯钛的表面形貌,作为种植体表面处理复合技术之一,是一种具有良好运用前景的表面处理方法。