背景:肺癌起源于支气管上皮细胞或肺泡上皮细胞,在组织学上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,后者约占肺癌的85%。非小细胞肺癌以肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）、肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）为主。最新的全球癌症统计数据显示,肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,也是全球癌症死亡率最高的恶性肿瘤。转移是肺癌高死亡率的主要原因,因为许多患者在初次诊断时,便出现局部组织侵犯或远处转移,这使得肺癌患者的生存率急剧下降。尽管有靶向药物用于治疗转移性肺癌患者,但仍然有很多患者不能从治疗中受益。为了寻找新的肺癌诊断和预后标志物,揭示肺癌转移的分子机制,我们对TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中的肺癌转录组数据进行了生信分析,得知谷胱甘肽过氧化物酶2（glutathione peroxidase 2,GPX2）在NSCLC组织中的表达显著高于正常肺组织,且高表达GPX2的NSCLC患者的预后差,提示GPX2可能影响了肺癌的进展及预后。GPX2是一种谷胱甘肽过氧化物酶,主要分布在包括食管、肝脏在内的全胃肠道中,调节细胞内活性氧水平,参与抗炎,预防肠黏膜炎症反应,保护上皮细胞免受摄入脂质过氧化物的损害;同时参与抗氧化,抑制炎症相关肿瘤的发生。基于TCGA数据生信分析显示GPX2在多种癌症中表达上调,包括LUAD、LUSC。然而GPX2在NSCLC中的作用机制还不清楚。在本研究中,我们探讨了GPX2在NSCLC中的表达及其临床意义、GPX2在NSCLC细胞中的功能及可能的分子机制,期望为NSCLC患者临床诊断和治疗策略提供新的方向。方法:一、GPX2在NSCLC中的表达及其临床意义1.下载TCGA数据库中泛癌转录组数据,生信分析GPX2 mRNA在包括LUAD、LUSC在内的各种癌症中的表达。2.采用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测GPX2 mRNA在10对NSCLC新鲜组织（癌和邻近正常肺组织）中的表达。3.采用RT-qPCR方法检测GPX2 mRNA在46对NSCLC新鲜组织（癌和邻近正常肺组织）中的表达。4.采用免疫组化染色技术检测GPX2蛋白在252对NSCLC石蜡包埋组织（癌及邻近正常肺组织）中的表达;采用基于免疫组织化学评分的半定量法评估GPX2蛋白的表达水平;收集患者的临床病理资料,通过电话随访了解患者的生存状态及生存时间。5.采用Χ~2检验分析252例NSCLC患者GPX2蛋白表达水平与临床病理因素的关系。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析GPX2蛋白表达水平与所有NSCLC患者以及具有相同病理因素患者总生存期（overall survival,OS）的关系;采用Cox回归分析影响NSCLC患者预后的相关因素。6.采用免疫组化技术检测GPX2蛋白在31例有淋巴结癌转移NSCLC患者组织（癌组织、邻近正常肺组织及阳性/阴性淋巴结）中的表达;采用半定量法进行免疫组化评分;应用Spearman相关系数及X~2检验分析GPX2蛋白表达在NSCLC原发灶和淋巴结转移灶中的相关性。7.使用receiver operating characteristic（ROC）曲线分析GPX2在NSCLC、LUAD、LUSC中的病理诊断价值。二、GPX2在NSCLC细胞中的功能及其机制研究（一）GPX2对NSCLC细胞EMT、迁移、侵袭和转移的影响1.采用RT-qPCR技术检测GPX2 mRNA在7个NSCLC细胞株中的表达,用人支气管上皮细胞株（human bronchial epithelial cell line,HBE）及人肺成纤维细胞株（human lung fibroblast cell line,HLF）作对照;采用Western blotting和免疫细胞化学方法检测GPX2蛋白在7个NSCLC细胞株中的表达。2.选择内源性GPX2高表达的NSCLC细胞株通过病毒感染的方法,构建稳定敲降GPX2的细胞株;选择内源性GPX2低表达的NSCLC细胞株通过病毒感染的方法,构建稳定过表达GPX2的细胞株;采用RT-qPCR和Western blotting方法检测稳定敲降和稳定过表达GPX2的NSCLC细胞株的敲降效率和过表达效率。3.使用光学显微镜观察稳定过表达GPX2的NSCLC细胞的形态改变。4.在稳定过表达和稳定敲降GPX2的NSCLC细胞株中,采用Western blotting方法检测上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关分子标记物的表达。5.采用划痕实验检测,稳定过表达和稳定敲降GPX2的NSCLC细胞株迁移能力的改变。6.采用Transwell不铺胶和铺胶实验检测,稳定过表达和稳定敲降GPX2的NSCLC细胞株迁移、侵袭能力的改变。7.建立裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞的肺转移模型,通过观察肺转移结节数量及大小,了解稳定敲降GPX2的NSCLC细胞在体内转移能力的改变;在肺转移结节中,采用免疫组化染色方法检测GPX2和EMT相关标记物的表达。（二）GPX2发挥功能的分子机制探讨1.DCFH-DA探针处理后,采用荧光显微镜和流式细胞术检测稳定过表达和稳定敲降GPX2的NSCLC细胞内活性氧水平（reactive oxygen species,ROS）的改变。2.将稳定敲降GPX2的NSCLC细胞和对照NSCLC细胞进行转录组测序;对转录组数据进行生信分析、筛选差异表达基因。3.对上述差异表达基因进行Gene Ontology（GO）分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析。4.在稳定过表达和稳定敲降GPX2的NSCLC细胞中,采用Western blotting方法验证GPX2调控的下游信号通路中相关蛋白的表达。结果:一、GPX2在NSCLC中高表达并且其高表达与患者不良预后相关1.TCGA数据库泛癌分析显示,GPX2 mRNA在多种人类肿瘤（配对和非配对）组织中存在差异表达;其中与正常肺组织相比,GPX2 mRNA在LUAD和LUSC组织中的表达显著上调。2.在10对新鲜NSCLC组织中,GPX2 mRNA在邻近正常肺组织中均不表达,但在5例癌组织中有表达,阳性率为50%。3.在46对新鲜NSCLC组织中,GPX2 mRNA在癌组织中的表达显著高于邻近正常肺组织。4.在252对石蜡包埋组织中,GPX2蛋白在NSCLC、LUAD、LUSC中表达,在邻近正常组织中几乎不表达;有166例NSCLC表达GPX2蛋白（其中86例高表达,80例低表达）,86例不表达GPX2蛋白。5.在252例NSCLC患者中,GPX2蛋白表达水平与性别（P＜0.001）、组织学类型（P＜0.001）、淋巴结转移（P＜0.001）、肿瘤大小（P=0.017）、TNM分期（P=0.022）相关。6.在NSCLC、LUAD和LUSC患者中,GPX2高表达者的总生存时间比GPX2低表达者短（NSCLC患者P＜0.001;LUAD患者P＜0.001;LUSC患者P=0.017）。7.单因素Cox模型分析结果显示,GPX2表达水平、淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期是影响NSCLC患者预后的重要因素（P＜0.001）。多因素Cox模型分析结果显示,GPX2表达水平同肿瘤大小及TNM分期一样,是影响NSCLC患者预后的独立因素（P=0.013,危险比HR=1.600）。8.对不同临床病理因素进行分层分析后显示,肿瘤大小＞3cm（P=0.001）、有淋巴结癌转移（P=0.038）、TNMⅠ期（P=0.010）或TNMⅢ期（P＜0.001）的NSCLC患者中,高表达GPX2蛋白者预后差;但在肿瘤大小≤3cm、无淋巴结癌转移或TNMⅡ期的患者中GPX2表达对总生存时间、总生存率无明显影响（P＞0.05）。9.在31例发生淋巴结转移的NSCLC患者的组织标本中,GPX2在淋巴结的转移性肺癌细胞中表达,但在淋巴结的淋巴细胞中不表达;GPX2蛋白在NSCLC的原发灶及淋巴结的转移灶中的表达,均显著高于邻近正常肺组织（P＜0.001）;并且,GPX2在肺癌组织和淋巴结转移癌中的表达呈强相关性（Spearman r=0.834,P＜0.001）,提示GPX2与NSCLC淋巴结转移密切相关。10.ROC曲线显示,GPX2在NSCLC、LUAD和LUSC中的曲线下面积（AUC）分别为0.793、0.767和0.835;同时,基于TCGA数据库中的NSCLC数据的分析结果显示,GPX2 mRNA在NSCLC、LUAD、LUSC中的AUC也均大于0.7,提示GPX2对诊断NSCLC、LUAD、LUSC具有较高的敏感性。二、GPX2在NSCLC中的功能及可能的分子机制（一）GPX2诱导NSCLC细胞发生EMT,促进迁移、侵袭能力,敲降GPX2则抑制NSCLC细胞在裸鼠体内的转移能力1.GPX2 mRNA在A549细胞株和H520细胞株中的表达高于其他肺癌细胞株以及HBE和HLF;GPX2蛋白在A549细胞株和H520细胞株中的表达高于其他肺癌细胞株。2.与对照细胞相比,GPX2 mRNA和蛋白的表达水平在稳定过表达GPX2的Anip973细胞株中均上调,在稳定敲降GPX2的A549、H520细胞株（sh1和sh2）中均下调,说明稳定过表达和敲降GPX2的NSCLC细胞株构建成功。3.与对照细胞相比,稳定过表达GPX2的Anip973细胞表现出了向间质样形态学变化的趋势。4.与对照细胞相比,在稳定过表达GPX2的Anip973细胞中,E-cadherin蛋白表达下调,Vimentin和Snail蛋白表达上调,而在稳定敲降GPX2的A549和H520细胞中,出现了相反的结果,这提示GPX2可能通过上调Snail蛋白促进了EMT。5.在划痕实验中,过表达GPX2促进了Anip973细胞的划痕愈合能力,敲降GPX2则减弱了A549和H520细胞的划痕愈合能力。6.在transwell不铺基质胶和铺基质胶实验中,过表达GPX2促进了Anip973细胞的迁移、侵袭能力,敲降GPX2则减弱了A549和H520细胞的迁移、侵袭能力。7.在裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞的肺转移实验中,实验组裸鼠（注射稳定敲降GPX2的A549细胞）的肺转移结节比对照组裸鼠（注射对照组细胞）的肺转移结节数量少、体积小;H＆E染色也进一步证实了该结果。同时,免疫组化染色结果显示,敲降GPX2后,E-cadherin蛋白表达上调,Vimentin蛋白表达下调。这些结果提示敲降GPX2抑制了NSCLC细胞在裸鼠体内的肺转移能力。（二）GPX2可减少NSCLC细胞中ROS水平,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路1.荧光显微镜下观察及流式检测结果显示,过表达GPX2可以降低Anip973细胞中探针的荧光强度,而敲降GPX2则可以增加A549和H520细胞中探针的荧光强度,这提示GPX2可以减少NSCLC细胞中的ROS水平。2.RNA测序结果显示,与对照细胞相比,在稳定敲降GPX2的A549细胞（sh1）中共鉴定出296个差异表达基因,其中上调的基因为249个,下调的基因为47个;与对照细胞相比,在稳定敲降GPX2的A549细胞（sh2）中共鉴定出150个差异表达基因,其中上调的基因为102个,下调的基因为48个。3.GO分析结果显示,在sh1 vs shNC（对照组）数据集中,差异基因的功能主要富集在通过质膜粘附的细胞-细胞粘附、细胞外基质、质膜蛋白复合物、细胞外结构组织、蛋白质细胞外基质等;在sh2和shNC数据集中,差异基因的功能主要富集在炎症反应、黏附连接、细胞外基质、蛋白质细胞外基质、膜区等。4.KEGG分析结果显示,在sh1 vs shNC数据集中,差异基因主要富集的通路为PI3K-AKT信号通路、细胞粘附分子（CAMs）和Ras信号通路等;在sh2 vs shNC数据集中,差异基因主要富集的通路为PI3K-AKT信号通路、Ras信号通路和Relaxin信号通路等。这些结果提示PI3K/AKT信号通路可能是GPX2调控的重要下游通路。5.与对照细胞相比,过表达GPX2增加了Anip973细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平,但未增加总PI3K和总AKT的水平;敲降GPX2降低了A549和H520细胞中的PI3K和AKT的磷酸化水平,但未改变总PI3K和总AKT水平。6.为了进一步证实GPX2对PI3K/AKT通路的影响,我们检测了PI3K/AKT通路直接下游靶点mTOR的磷酸化水平。结果显示与对照细胞相比,过表达GPX2增加了Anip973细胞中mTOR的磷酸化水平,但未增加总的mTOR水平;敲降GPX2降低了A549和H520细胞中的mTOR的磷酸化水平,但未改变总的mTOR水平。结论:1.GPX2在NSCLC组织中表达,但在邻近正常肺组织中几乎不表达。2.GPX2高表达与NSCLC患者预后不良相关。3.GPX2蛋白表达与NSCLC患者的淋巴结转移、肿瘤大小、TNM分期有关。4.GPX2蛋白表达在NSCLC的原发灶与淋巴结转移灶之间具有强相关性。5.在体外,GPX2促进NSCLC细胞发生EMT、迁移和侵袭;在裸鼠体内,敲降GPX2抑制NSCLC细胞的转移能力。6.GPX2下调NSCLC细胞内ROS水平,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。