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研究背景肺癌是全球发病率第二,死亡率第一的恶性肿瘤,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancerNSCLC）是占比最大的亚型,由于其起病的隐匿性和初发症状的不典型,大多数患者在诊断时已出现远处转移。NSCLC的转移是一种诱因复杂、控制困难的病理进程,NSCLC细胞可通过发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）而获得远处转移能力,因此探究肺癌EMT发生的诱因和机制至关重要。我们前期研究发现,α5-nAChR和p-Stat3之间相互激活,在尼古丁促进NSCLC的增殖中起重要作用,但α5-nAChR在NSCLC细胞EMT及转移中的作用尚待研究。因此,在第一部分研究中,我们针对“α5-nAChR调节p-Stat3/Jab1信号轴实现对NSCLC细胞EMT及远处转移的调控”这一假设开展研究工作。研究发现,Gli2在吸烟相关性肿瘤中发挥重要作用,我们应用生物信息学方法分析Gli1/Gli2对NSCLC患者预后的影响,发现只有Gli2高表达预示临床预后不良,且α5-nAChR启动子区域存在Gli2结合位点。因此第二部分研究中,我们针对“Gli2调节α5-nAChR来调控NSCLC细胞的EMT及转移”这一假设开展研究工作。研究目的1.研究α5-nAChR调控Stat3/Jab1信号通路在NSCLC细胞EMT中的作用及机制。2.研究Gli2调控α5-nAChR在NSCLC细胞EMT中的作用及机制。研究方法1.第一部分1.1在线生物信息学网站分析α5-nAChR和Jab1在肺癌中的表达水平、相关性和对生存期的影响。1.2免疫组化检测肺癌组织芯片中α5-nAChR和Jab1的表达水平并分析其与临床病理参数的关系。1.3 Westernblot检测尼古丁作用下α5-nAChR及Jab1在A549和H1299中的表达水平。1.4 Western blot检测:沉默Jab1后EMT Marker的表达情况;过表达α5-nAChR、t-Stat3、p-Stat3、Jab1和EMT Marker的表达情况;沉默CHRNA5后t-Stat3、p-Stat3及EMT Marker的表达情况;单独沉默CHRNA5或t-Stat3,与同时沉默CHRNA5+t-Stat3比较,Jab1的表达情况。1.5 ChIP实验检测Jab1启动子区域有无p-Stat3的结合位点。1.6划痕和Transwell迁移和侵袭实验检测:α5-nAChR过表达后A549和H1299细胞的侵袭和迁移能力;沉默α5-nAChR、Jab1后A549和H1299细胞的侵袭和迁移能力。1.7动物实验:免疫组化方法检测皮下成瘤组织中α5-nAChR和Jab1的表达水平;HE染色观察肿瘤肺转移情况。2.第二部分2.1生物信息学网站分析Gli2表达水平对生存期的影响。2.2免疫组化方法检测肺癌组织芯片中Gli2的表达水平并分析其与临床病理参数的关系。2.3 Western blot方法检测尼古丁作用下Gli2和α5-nAChR在A549和H1299中的表达水平。2.4 ChIP实验检测α5-nAChR启动子区域有无Gli2的结合位点。2.5 Western blot方法检测Gli2过表达和敲除后α5-nAChR、Jab1及EMT marker的表达水平。2.6划痕和Transwell迁移和侵袭实验检测Gli2过表达和敲除后A549和H1299细胞的侵袭和迁移能力。2.7免疫组化方法检测皮下成瘤组织中Gli2和α5-nAChR的表达水平;HE染色观察肿瘤肺转移情况。研究结果1.第一部分1.1 α5-nAChR及Jab1在NSCLC组织中高表达且预示临床预后不良生物信息学分析结果显示,α5-nAChR和Jab1均在NSCLC中高表达,正相关。高表达α5-nAChR和Jab1患者的生存期低于低表达患者。芯片免疫组化染色结果显示,α5-nAChR及Jab1在癌组织中高表达。α5-nAChR和Jab1的表达与性别及年龄无关（P＞0.05）,与TNM分期正相关（P=0.013,P=0.036）。皮下成瘤组织免疫组化结果显示,与KD组相比,α5-nAChR和Jab1在NC组中高表达;与A549 Ctrl组相比,α5-nAChR和Jab 1在A549 α5-nAChR+组中高表达。1.2尼古丁刺激增加NSCLC细胞株中α5-nAChR及Jab1的表达Western blot结果显示:在A549和H1299细胞株中,α5-nAChR和Jab1表达正相关。使用1μM和10μM尼古丁作用于A549和H1299细胞16H,α5-nAChR和Jab1的表达量以非浓度依赖方式增加。1.3 α5-nAChR通过调节Stat3/Jab1通路调控NSCLC细胞的EMT和体外迁移侵袭Western blot 结果显示:沉默 Jab1 后,EMT marker N-cadherin 和 Vimentin 表达水平降低;α5-nAChR 过表达后,t-Stat3 水平无明显变化,p-Stat3、Jab1、N-cadherin 和 Vimentin表达水平增加;α5-nAChR沉默后,t-Stat3水平无明显变化,p-Stat3、Jab1、N-cadherin和Vimentin表达水平降低;与单独沉默α5-nAChR或Stat3相比,同时沉默α5-nAChR和Stat3后,Jab1表达水平最低。ChIP实验结果显示,p-Stat3是Jab1的转录因子。划痕和Transwell迁移和侵袭结果显示,沉默Jab1后,A549和H1299细胞迁移侵袭能力减弱;α5-nAChR过表达后,其迁移侵袭能力增强;沉默后,其迁移侵袭能力减弱。1.4 α5-nAChR调节NSCLC细胞体内转移能力裸鼠肺组织HE染色结果显示,α5-nAChR+组裸鼠肺内转移灶明显多于NC组。2.第二部分2.1 Gli2在NSCLC组织中高表达且预示临床预后不良生物信息学分析结果显示,高表达Gli2的患者的生存期低于低表达患者。芯片免疫组化染色结果显示,Gli2在癌组织中高表达;Gli2表达与性别及年龄无关（P＞0.05）,与TNM分期正相关（P=0.004）。皮下成瘤组织免疫组化结果显示,与Ctrl组相比,Gli2和α5-nAChR在Gli2+组中高表达。2.2尼古丁刺激增加NSCLC细胞株中Gli2的表达Western blot结果显示当尼古丁作用时间为12H或16H,作用浓度为2μM或10μM的时候,Gli2的表达量增加最为显著。2.3 Gli2通过调节α5-nAChR调控NSCLC细胞的EMT和体外迁移侵袭Gli2过表达后,α5-nAChR、Jab1、N-cadherin和Vimentin表达水平增加;敲除后,上述分子表达水平降低。ChIP实验结果显示,Gli2是α5-nAChR的转录因子。划痕和Transwell迁移和侵袭结果显示,Gli2过表达后,A549和H1299细胞迁移侵袭能力增强;沉默后,其迁移侵袭能力减弱。2.4 Gli2调节NSCLC细胞体内转移能力裸鼠肺组织HE染色结果显示,Gli2+组裸鼠肺内转移灶明显多于NC组。研究结论1.Gli2、α5-nAChR、Jab1在NSCLC组织中高表达且预示临床预后不良。2.尼古丁刺激增加NSCLC细胞中Gli2、α5-nAChR、Jab1的表达。3.α5-nAChR通过调控Stat3/Jab1信号轴促进NSCLC细胞EMT和体外体内侵袭迁移。4.Gli2通过调控α5-nAChR促进NSCLC细胞EMT和体外体内侵袭迁移。